Summary

Roman passif méthodes de compensation pour la Production rapide de transparence optique dans tout le tissu CNS

Published: May 08, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici deux nouvelles méthodes, psPACT et mPACT, pour réaliser la transparence optique maximale et l’analyse microscopique ultérieure de la vascularisation des tissus chez le rongeur intact entier CNS.

Abstract

Depuis la mise au point de clarté, une bioelectrochemical technique de compensation qui permet pour la cartographie en trois dimensions de phénotype au sein des tissus transparents, une multitude de méthodes de compensation roman notamment cubique (l’imagerie cérébrale claire et dégagée cocktails et analyse computationnelle), SWITCH (contrôle systémique du temps de l’interaction) et la cinétique des produits chimiques, carte (grossie analyse du protéome) et Pacte (technique de clarté passive), ont été établis afin d’accroître la boîte à outils existant pour l’analyse microscopique des tissus biologiques. La présente étude vise à améliorer et optimiser la procédure initiale de Pacte pour une gamme de tissus de rongeurs intacts, y compris l’ensemble du système nerveux central (CNS), les reins, rate et des embryons de souris tout. Appelé psPACT (Pacte de processus-Remscheid) et mPACT (mis à jour le Pacte), ces nouvelles techniques fournissent des moyens très efficaces de cartographie des circuits de cellules et la visualisation des structures subcellulaires dans les tissus normaux et pathologiques intacts. Dans le protocole suivant, nous fournissons un aperçu détaillé, étape par étape sur comment réaliser le dégagement maximal tissu avec atteinte minimale à leur intégrité structurale via psPACT et mPACT.

Introduction

Des objectifs fondamentaux de l’enquête scientifique et clinique consiste à atteindre une compréhension complète de la structure de l’organe et la fonction ; Toutefois, la nature extrêmement complexe d’organes chez les mammifères sert souvent de barrière pour atteindre pleinement cet objectif1. CLARTÉ (lipides claire-échangé hybridé Acrylamide rigide compatible avec l’imagerie violets-hYdrogel)2,3,4, qui prévoit la construction d’un hybride d’hydrogel axée sur l’acrylamide de tissus intacts, réalise espace optique de divers organes, y compris le cerveau, le foie et la rate, tout en préservant leur intégrité structurale5. CLARTÉ a ainsi permis de non seulement visualisation, mais aussi l’occasion de disséquer finement les réseaux cellulaires complexes et morphologies de tissus sans la nécessité pour le sectionnement.

Afin de réaliser le dégagement de tissu, clarté emploie des méthodes électrophorétiques pour éliminer la teneur en lipides de l’échantillon à portée de main. Alors que la clarté a été notée pour produire des hybrides de tissu-hydrogel physiquement stable, des études ont montré que son utilisation des méthodes de compensation (etc.) tissu électrophorétique donne des résultats variables en termes de qualité de tissus, y compris le brunissement, épitope dommage, et protéine perte5,6. Pour résoudre ces problèmes, les protocoles modifiés tels que le Pacte (Technique PAssive de clarté), qui remplace le traitement ETC avec une technique de délipidation fonction passive, ionique-détergent, ont été développés7,8,9. Malgré la réalisation d’une plus grande cohérence dans les résultats, cependant, Pacte exige plus de temps pour obtenir l’autorisation maximale. En outre, aucune de ces techniques ont encore été appliqué à la forme de CNS entier, ou dans des modèles plus grands rongeurs comme les rats et les cobayes.

La présente étude vise à pallier ces lacunes en proposant de nouvelles méthodes, psPACT (Pacte de processus-Remscheid) et mPACT (mis à jour le Pacte), pour faciliter le dégagement rapide de la CNS entier et des organes internes à la souris et le rat modèles10. Plus précisément, psPACT traite les tissus à 4 % d’acrylamide et 0,25 % VA-044 en deux étapes distinctes au cours de la formation de l’hydrogel ; mPACT essentiellement basée sur les mêmes étapes, mais complète la solution de compensation basée sur SDS avec 0,5 % α-thioglycérol comme un réactif de clés. Les deux techniques d’exploiter les systèmes circulatoires systémiques et céphalo-rachidien endogènes pour réduire considérablement le temps nécessaire pour produire la clairance optique. Comme une preuve de principe, nous montrent l’utilisation de la microscopie confocale à analyser les tendances des vaisseaux sanguins dans les tissus dégagé10.

Protocol

Toutes les méthodes qui ont été approuvés par le Comité d’éthique de recherche appropriées à la faculté de médecine de l’Université de Yonsei. Tous les animaux sont sacrifiés selon les orientations de la Comité de protection des animaux de laboratoire à la faculté de médecine de l’Université de Yonsei. 1. préparation des réactifs ATTENTION : Paraformaldéhyde (PFA), acrylamide et sodium dodecyl sulfate (SDS) sont irritants toxiques et doivent…

Representative Results

Génération d’un modèle transparent de la CNS tout en utilisant des techniques de compensation passive optimisée Optique apurement des souris et le rat des tissus de CNS entiers a été réalisée rapidement en utilisant diverses techniques de compensation passive (Figure 1). Un schéma du tissu de compensation au fil du temps est illustré dans la Figure 2…

Discussion

Alors que les méthodes d’extraction passive, non-électrophorétique employées dans Pacte amélioré de manière significative la consistance obtenue avec tissu précédent compensation des méthodes telles que clarté2,3,4,7 , 8, la technique porte encore plusieurs lacunes, les plus pressants dont sont la longueur du temps nécessaire pour atteindre les t…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le projet cerveau Corée 21 avec pour la Science médicale, Université de Yonsei. En outre, ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (FRO-2017R1D1A1B03030315).

Materials

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix, Inc. 75819 Clearing solution
Nycodenz Axia-Shield 1002424 nRIMS solution
40% Acrylamide Solution Bio Rad Laboratories, Inc. 161-0140 Polymerization (A4P0)
2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 017-19362 Polymerization (VA-044)
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M1753-100ML Clearing solution (mPACT)
Tween-20 Georgiachem 9005-64-5 nRIMS solution
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML Immuno Staining
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSA100 Immuno Staining
Heparin Merck Millipore 375095 Perfusion (PBS)
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-25G nRIMS solution
PECAM-CD31 antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-28188 Immuno Staining
Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate Jackson ImmunoResearch Inc. 111-165-003 Immuno Staining
4% Paraformaldehyde Tech & Innovation BPP-9004 Perfusion, Polymerization
20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) Tech & Innovation BPB-9121 Perfusion, Buffer
10 mL stripette Coatar 4488 Solution transfer
50 mL tube Falcon 352070 Clearing tube
35 mm Cell culture dish SPL 20035 Imaging
Confocal dish SPL 211350 Imaging
1 mL syringe Korea vaccine Co., Ltd 26G 1/2 Anesthetize 
50 mL syringe Korea vaccine Co., Ltd 21G1 1/4 Perfusion
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 Polymerization (A4P0)
Whatman 3MM paper Sigma-Aldrich Z270849 Blotting paper for gel removal
Confocal microscope Zeiss LSM780 Imaging
ZEN lite Software Zeiss ZEN 2012 Imaging
Peristaltic pump Longerpump BT100-1F Perfusion
EasyGel Lifecanvas Technologies EasyGel Tissue gel hybridization system

Riferimenti

  1. Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  3. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  4. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
  5. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
  6. Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
  7. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  8. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  9. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
  10. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  12. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  13. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  14. Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
  15. Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
  16. Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
  17. Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).

Play Video

Citazione di questo articolo
Woo, J., Lee, E. Y., Park, H., Park, J. Y., Cho, Y. E. Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue. J. Vis. Exp. (135), e57123, doi:10.3791/57123 (2018).

View Video