Recuperação de fluorescência zigóticos após o clareamento foto análise por frouxidão de cromatina que permite o desenvolvimento do termo
Summary
Frouxidão de cromatina parece estar envolvido no desenvolvimento potencial dos blastómeros. No entanto, não se sabe se a frouxidão de cromatina pode ser usado como um índice confiável para o potencial do desenvolvimento de embriões. Aqui, tem sido descrito um sistema experimental no qual zigotos de frouxidão-avaliada de cromatina podem desenvolver à gestação completa.
Abstract
Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa que permite a análise dos eventos moleculares durante a ontogênese. Recentemente, frouxidão de cromatina ou abertura tem demonstrada ser envolvido no potencial de diferenciação celular de células-tronco embrionárias pluripotentes. Anteriormente foi relatado que em comparação com células-tronco embrionárias, zigotos abrigam uma estrutura extremamente afrouxada cromatina, sugerindo sua associação com sua totipotência. No entanto, até agora, isso não foi resolvido se essa estrutura extremamente solta/abrir cromatina é importante para o potencial do desenvolvimento embrionário. No presente estudo, para examinar esta hipótese, foi desenvolvido um sistema experimental no quais zigotos que foram analisados por fluorescência recuperação após o clareamento foto pode desenvolver a termo sem qualquer dano significativo. Importante, este sistema experimental precisa de apenas um aquecedor térmico-placa além de um laser confocal microscópio. As conclusões deste estudo sugerem que recuperação de fluorescência após análise de análise (FRAP) foto-branqueamento pode ser usado para investigar se os eventos moleculares na cromatina zigóticos são importantes para o desenvolvimento do termo.
Introduction
Após a fertilização, a estrutura da cromatina é alterada dinamicamente, e estrutura da cromatina zigóticos é então eventualmente estabelecido1,2. Durante este período, em pró-núcleos paternos, proteínas da cromatina dominante é mudada de protamina na histona. A cromatina resultante é extremamente diferente dos espermatozoides e ovócitos femininos em vários pontos (por exemplo, composição variante de histona, modificação de histona). Assim, a cromatina foi formada é pensada para ser importante para o posterior desenvolvimento embrionário. No entanto, apesar dos esforços para revelar os detalhes da estrutura da cromatina zigóticos durante longos períodos, métodos para avaliar a qualidade de zigotos ou para prever seu desenvolvimento termo na fase de uma célula, analisando sua estrutura da cromatina nunca foram estabelecido.
No estudo anterior, é descoberto que zigotos tem uma estrutura extremamente afrouxada cromatina3. Atualmente, frouxidão de cromatina ou abertura é acreditada para ser um importante factor de diferenciação celular potencial de células estaminais embrionárias (ES)4. Pilhas do ES não apresentam homogeneidade na natureza, mas são bastante heterogêneas; em colônias de células ES, alguns transitoriamente adquirem um maior potencial de diferenciação comparável aos blastômeros de embriões do estágio de duas células. Durante esta transição para a dois-célula como estado, frouxidão de cromatina no ES células no que é comparável com o estágio de duas células de embriões5alterações. Assim, frouxidão de cromatina parece ser importante para o potencial de diferenciação celular e é possível que abrir extensivamente cromatina em zigotos é útil para a avaliação do potencial de desenvolvimento zigóticos.
Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa que permite a análise dos eventos moleculares durante a ontogênese desde que esse método permite o posterior desenvolvimento e até mesmo termo desenvolvimento6. Como um dos métodos de imagem ao vivo, FRAP análise tem sido usado para examinar a frouxidão de cromatina embriões pré-implantação e ES células3,4,5. Se frouxidão zigóticos cromatina pode ser analisado sem um efeito prejudicial sobre o termo desenvolvimento pela análise FRAP, pode ser uma ferramenta valiosa para a avaliação da qualidade dos embriões na fase de uma célula. No entanto, os efeitos sobre o desenvolvimento do termo por esse método experimental não foram examinados. Recentemente, um sistema experimental usando FRAP avaliar frouxidão zigóticos cromatina foi desenvolvido. Porque este era um novo sistema de observação de zigotos, ele foi denominado como zigóticos FRAP (zFRAP). zFRAP não afetou criticamente termo desenvolvimento e tem sido relatado em outro lugar7. Neste relatório, é descrito o protocolo desse método experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como revelado neste estudo, a análise zFRAP não causa danos críticos para o desenvolvimento do termo, sugerindo que este método é uma ferramenta muito útil para revelar a associação entre eventos moleculares e o potencial do desenvolvimento embrionário. Durante a reprogramação, para as duas câmaras como estado de pilhas do ES, pelo qual o potencial diferencial dessas células torna-se tão elevado como aquele do estágio de duas células, frouxidão de cromatina de mudanças em que comparável com embriões d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura e Kana Kishida fornecendo comentários críticos e suporte técnico. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo programa do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia para promover a reforma das universidades nacionais, m.o.; a sociedade japonesa para a promoção da ciência (16H 02593), Asada Science Foundation e da Fundação de ciência Takeda para TW Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
Riferimenti
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