Summary

Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций

Published: May 10, 2019
doi:

Summary

Мы описываем пошаговые инструкции: 1) эффективно инженер кишечных органоидов с помощью магнитных наночастиц для ленти- или ретровирусной трансдукции, и, 2) генерировать замороженные секции из инженерных органоидов. Этот подход является мощным инструментом для эффективного изменения экспрессии генов в органоидах для исследования эффектов ниже по течению.

Abstract

Кишечные органоидные культуры предоставляют уникальную возможность исследовать кишечные стволовые клетки и биологии склепа in vitro, хотя эффективные подходы к манипулированию экспрессией генов в органоидах добились ограниченного прогресса в этой области. В то время как технология CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать геном клетки для генерации органоидов, эта стратегия требует тщательного отбора и скрининга путем анализа последовательности, что является одновременно трудоемким и дорогостоящим. Здесь мы предоставляем подробный протокол для эффективного вирусного трансдукции кишечных органоидов. Такой подход является быстрым и высокоэффективным, что сокращает время и расходы, присущие технологии CRISPR/Cas9. Мы также представляем протокол для генерации замороженных участков из нетронутых органоидных культур для дальнейшего анализа с иммуногистохимическим или иммунофлуоресцентным окрашиванием, которое может быть использовано для подтверждения экспрессии генов или замалчивания. После успешного трансдукции вирусных векторов экспрессии генов или замалчивания, кишечные стволовые клетки и функции крипты могут быть быстро оценены. Хотя большинство органоидных исследований использовать в пробирке анализы, органоиды также могут быть доставлены мышам для in vivo функциональный анализ. Кроме того, наши подходы являются выгодными для прогнозирования терапевтических реакций на наркотики, потому что в настоящее время доступны терапии обычно функции модуляции экспрессии генов или белковой функции, а не изменения генома.

Introduction

Способность к культуре мыши или человека склепы клеток, как трехмерные (3D) органоидов из тонкого кишечника или толстой кишки в течение длительных периодов времени при условии крупного прорыва, потому что эти культуры отображают определяющие особенности кишечного эпителия in vivo 1 , 2 , 3. Органоиды, полученные из первичных склепов, способны к самообновлению и самоорганизации, демонстрируя клеточные функции, аналогичные их тканям происхождения. Действительно, органоиды резюмируют не только структурную организацию склепов in vivo, но и многие молекулярные особенности, обеспечивая тем самым полезные инструменты для изучения нормальной биологии и состояния болезней. Чтобы проиллюстрировать, органоидные исследования выявилиновые молекулярные пути, участвующие в регенерации тканей 1,2,3,4,5, а также препараты, которые могли бы улучшить функцию в патологическихусловиях 6,7.

Изучение кишечных стволовых клеток представляет особый интерес, поскольку кишечная подкладка является одной из наиболее регенеративных тканей млекопитающих, обновляя себя каждые 3-5 дней, чтобы защитить организм от бактерий, токсинов и других патогенов в кишечные люмены. Кишечные стволовые клетки (ISCs) несут ответственность за эту замечательную регенеративную способность и, таким образом, обеспечивают уникальную парадигму для изучения функции стволовых клеток взрослых1,2. Линейные исследования экспериментов на мышах показали, что изолированные Lgr5-положительные стволовые клетки могут быть культивированы для генерации 3D-органоидов или «мини-кишки» в пробирке, где они тесно отражают свои аналоги in vivo. Органоидные культуры также могут быть получены из изолятов клеток кишечных склепов, состоящих из прародителей, МЦКов и клеток Панета, последние из которых составляют эпителиальные нишевые клетки in vivo. На самом деле, органоидная культура из первичных клеток кишечного склепа превратилась в относительно рутинную технику, которую легко реализовать в большинстве лабораторий с использованием широко доступных реагентов. Эта модель также поддается количественному анализу экспрессии генов с помощью РНК-секвенирования (РНК-Сек) и белков масс-спектрометрией, иммуногистохимией или иммунофлуоресцентным окрашиванием2,4,8. Кроме того, функциональная генетика может быть изучена с помощью усиления функции (переэкспрессия гена или экспрессии активирующего мутантного гена) или потери функции (заглушение гена или экспрессия мутанта потери функции) приближаетсяк2.

Важно отметить, что низкая эффективность и высокая токсичность стандартной плазмидной ДНК или вирусных протоколов трансдукции с полибреном остаются основным препятствием в этой области. Хотя технология CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать геном, этот подход требует многовремени выбора с последующим проверкой последовательности9. Здесь мы представляем протокол вирусной трансдукции для первичных кишечных органоидов, который оптимизирует доставку вирусных частиц путем спряжения к магнитным наночастицам и применения магнитного поля. Приводятся ключевые измененияв предыдущие протоколы 4,5,10,11,12,13 и рекомендации по повышению эффективности. Мы также описываем подход к созданию замороженных секций из нетронутых органоидов, культивированных в 3D матригель (отсюда называют подвал мембранной матрицы или матрицы) для дальнейшего анализа с иммуногистохимии или иммунофлуоресцентного окрашивания.

Protocol

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и использованию медицинских учреждений Джонса Хопкинса (IACUC). Этот протокол изменяется из ранее опубликованных методов10,11,12,13. 1. Подготовка реаг…

Representative Results

Здесь мы описываем быструю и высокоэффективную технику трансдукции, которая использует магнитные наночастицы, подвергающиеся воздействию магнитного поля, чтобы доставить лентивирус к клеткам, представляющим интерес. С легкодоступными инструментами, мы применили э?…

Discussion

Первичная культура эпителия кишечника у взрослых в качестве органоидов обеспечивает мощный инструмент для изучения молекулярных механизмов, участвующих в функции стволовых клеток, эпителиального гомеостаза кишечника и патологии1,2,<…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами От Национального института здравоохранения (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Мэриленд Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), Американской ассоциации легких, Allegheny Health Network – Johns Научно-исследовательский фонд Хопкинса и Центр основных исследований в области заболеваний пищеварения Хопкинса.

Materials

DMEM Thermo Fisher Scientific 11965092 Base medium for 293T cells
DMEM/F12+ Thermo Fisher Scientific 12634010 Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer
OPTI-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 Virus plasmids transfection medium
Fetal Bovine Serum Corning 35-011-CV Component of virus collection medium and 293T medium
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific 15140122 Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer
PBS (without Ca2+, Mg2+) Thermo Fisher Scientific 10010049 A wash buffer and component of crypt dissociation buffer
Mem-NEAA Thermo Fisher Scientific 11140050 Component of organoid culture medium
GlutamaxII Thermo Fisher Scientific 35050061 Component of organoid culture medium
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080 Component of organoid culture medium
EGF Millipore Sigma E9644 Component of organoid culture medium
Noggin Peprotech 250-38 B Component of organoid culture medium
R-spondin R&D 7150-RS-025/CF Component of organoid culture medium
Human recombinant insulin Millipore Sigma I9278-5ml Component of organoid culture medium
Nicotinamide Millipore Sigma N3376-100G Component of Transduction medium
Wnt3A R&D 5036-WN-010 Component of Transduction medium
Y27632 Millipore Sigma Y0503-1MG Component of Transduction medium
0.5M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Component of Crypts dissociation buffer
DTT (dithiothreitol) Thermo Fisher Scientific R0861 Component of Crypts dissociation buffer
Dispase I Millipore Sigma D4818-2MG Component of organoid digestion buffer
DNase I Millipore Sigma 11284932001 Component of organoid digestion buffer
matrigel(Growth factor reduced) Corning 356231 Used as a matrix to embed organoids
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985070 Medium for transfection in viral production
ViralMag R/L Oz Biosiences RL40200 Magnetic particles of viral transduction
Magnetic plate Oz Biosiences MF10000 Magnetic plate to facilitate viral transduction
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019 Transfection agent in viral production
Poly-D-Lysine Millipore Sigma A-003-E Coating for plates before seeding 293T cells
4% Formaldehyde Solution Boster AR1068 Solution to fix organoids
O.C.T embedding compound Thermo Fisher Scientific 4583S For embedding of the the organoids
5 mL Falcon polystyrene tubes Corning 352054
50 mL Falcon Tubes Sarstedt 62.547.100
Orbitron rotator II Rocker Shaker Boekel Scientific 260250
Olympus Inverted microscop CK30 Olympus CK30 for scanning and counting crypts
Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence Nikon Axiovert 200 for viewing fluorescence in the crypts
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane Milipore Sigma UFC910024 For concentrating viruses
pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) pluriSelect SKU 43-50020 For preparing organoid fragments
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 352340 For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) Millipore Sigma M8937-100EA ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments
Animal strain: C57BL/6J Jackson Lab #000664 For organoid culture

Riferimenti

  1. Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
  2. Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
  5. Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
  6. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  7. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
  8. Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
  9. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
  10. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
  11. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
  12. Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
  15. Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
  16. Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).

Play Video

Citazione di questo articolo
Xian, L., Chia, L., Georgess, D., Luo, L., Shuai, S., Ewald, A. J., Resar, L. M. Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning. J. Vis. Exp. (147), e57040, doi:10.3791/57040 (2019).

View Video