عزل وتوصيف المجهرية الدقيقة المستمدة من العَدلات للدراسات الفنية
Summary
بروتوكولات جديدة ويرد هنا لعزل وتوصيف المجهرية الدقيقة المستمدة من الإنسان والفأر العَدلات. استخدام هذه البروتوكولات تنبيذ فائق، والتدفق الخلوي والتقنيات إيمونوبلوتينج لتحليل محتوى يمثل، ويمكن استخدامها لدراسة دور المجهرية الدقيقة المستمدة من مختلف أنواع الخلايا في وظيفة الخلوية.
Abstract
المجهرية الدقيقة النوى المستمدة من العَدلات (المجنحة)-MPs) الدهن بلير، ميكروفيسيكليس كروية بأحجام تتراوح بين 50 – 1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط في القطر. نحو النواب الناشئة حديثا، وجزءاً هاما من خلية إلى خلية الاتصال وإرسال الإشارات إليه. بسبب حجمها وطبيعة الإفراج عنهم، تم إغفال وجود النائب حتى وقت قريب. ومع ذلك، مع تحسين التكنولوجيا والأساليب التحليلية الآن يبرز وظيفتها في الصحة والمرض. هي البروتوكولات المقدمة هنا تهدف إلى عزل ووصف النواب المجنحة التدفق الخلوي وإيمونوبلوتينج. وعلاوة على ذلك، يتم إعطاء أمثلة عدة على التنفيذ. هذه البروتوكولات لعزل النائب سريعة ومنخفضة التكلفة، ولا تتطلب استخدام معدات باهظة الثمن. وعلاوة على ذلك، أنها تسمح لتسمية أعضاء البرلمان بعد العزلة، فضلا عن وضع العلامات مسبقاً من الخلايا المصدر قبل الإفراج عن النائب، استخدام صبغة فلورسنت الخاصة بغشاء للتصور والتحليل عن طريق التدفق الخلوي. ومع ذلك، قد هذه الطرق، العديد من القيود بما في ذلك النقاء بمنس وأعضاء البرلمان والحاجة إلى الأدوات التحليلية المتطورة. Cytometer تدفق الراقية مطلوب لتحليل MPs موثوق بها والتقليل من قراءة إيجابية كاذبة بسبب الضوضاء أو السيارات-الأسفار. البروتوكولات وصف يمكن استخدامها لعزل وتعريف النائب نشوء حيوي، وتميز علامات والاختلاف في تكوين ظروف محفزة مختلفة. تباين حجم يمكن استغلالها للتحقيق في ما إذا كان محتوى جزيئات الغشاء مقابل اكسوسوميس مختلفة، وما إذا كان أنها تفي بأدوار مختلفة في الأنسجة التوازن. وأخيراً، يمكن استكشاف عزل وتوصيف لأعضاء البرلمان، ووظيفتها في الاستجابات الخلوية ونماذج مختلفة من المرض (بما في ذلك، اضطرابات الالتهابات المرتبطة المجنحة، مثل أمراض الأمعاء الملتهبة أو إصابة الرئة الحاد) التالية.
Introduction
في الآونة الأخيرة، أصبحت “المجهرية الدقيقة/ميكروفيسيكليس” مصدرها سيتوسول الخلية أو غشاء البلازما ذات أهمية علمية كبيرة، كما تشير البيانات الناشئة أن هذه الهياكل، وتتراوح بين 50-1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط في القطر، ويمكن أن تحمل المعلومات البيولوجية و بمثابة وسيلة غير مقبول للاتصالات الخلوية. المناعية الخلية المستمدة من أعضاء البرلمان، ولا سيما تلك التي تنتجها العَدلات النوى (بمنس) ذات أهمية كبيرة نظراً للدور الهام بمنس في المضيف الدفاع1،2، الردود الملتهبة3، والتئام الجروح 4-الفضول، حتى الآن، أظهرت تقارير عديدة وظائف كل برو-التهابات والالتهابات من النواب المجنحة5، مما يوحي سياق المحتملة-والمرض-والأنواع-والدور الخاصة بالجهاز من أعضاء البرلمان.
توفر البروتوكولات الموصوفة في هذه الاتصالات وسيلة فعالة من حيث التكلفة ومبتكرة وقابلة للتكيف لدراسة وظيفة البرلمان في الصحة والمرض. وتنطبق على العديد من الكائنات النموذجي، والأجهزة، وشروط التحفيز. أنها تسمح للتعرف على أنواع عدة من أعضاء البرلمان، ويمكن استخدامها في المستقبل للتصدي لمهامها برو-التهابات والالتهابات. على سبيل مثال، وصف هنا كيف يمكن لدراسة وظيفة MPs المجنحة في الجرح الظهارية الشفاء في المختبر و في فيفو. البروتوكول المقدم لعزل الماوس بمنس المشتقة من نخاع العظم تم تكييفها مع بعض التعديلات من أسلوب هو موضح سابقا6.
وعلاوة على ذلك، تسمح البروتوكولات المذكورة في هذه الدراسة لكشف وتوصيف علامات محددة التي يمكن العثور على أعضاء البرلمان المجنحة بطريقتين تكمل: الغربية لطخة والتدفق الخلوي. ونجد أن إيمونوبلوتينج من أعضاء البرلمان باستخدام البروتوكولات القياسية5 سهلة ويمكن الاعتماد عليها، إلا أن التقدم الذي أحرز مؤخرا في حساسية أدوات قياس التدفق، ونسبة الضجيج إلى إشارة أفضل تسمح الآن لمزيد من التحليل لأعضاء البرلمان باستخدام هذا الأسلوب. تتضمن البروتوكولات الموصوفة في هذه الدراسة التطورات الأخيرة والتوصيات من المقالات والبحوث الأصلية، بما في ذلك إدخال تعديلات على سرعة الطرد المركزي، والوقت، إضافة نموذج التصفية وتجميد/تخزين شروط7 , 8، وكيفية الحد من “ضجيج الخلفية”، وتحسين حد الكشف لأعضاء البرلمان المجنحة، وتميز بين الأحجام المختلفة لأعضاء البرلمان.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكولات لعزل وتوصيف المجنحة المستمدة من أعضاء البرلمان موصوفة في هذا البلاغ. ويجب مراعاة العديد من النقاط الحرجة الرئيسية لنجاح هذا الإجراء. أولاً، يجب عزل طازجة بمنس والمستخدمة في التجارب داخل ح 2 من العزلة لمنع التنشيط التلقائي وتحبب. يجب أن يتم التعامل مع جميع من بمنس خلال العزلة وح?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للمساعدة التقنية للدكتور سواميناثان سوشيترا الذي يدير الأساسية “شمال غرب فينبيرج مدرسة للطب التدفق الخلوي”. تم توفير التمويل من خلال DK101675 (المعاهد الوطنية للصحة).
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
Riferimenti
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
