Her presenterer vi en protokoll for å få tre farger smFRET data og analyse med en 3D ensemble Hidden Markov Model. Med denne tilnærmingen, kan forskere trekke kinetic informasjon fra komplekse protein-systemer, inkludert cooperativity eller korrelert interaksjoner.
Single-molekylet han selvmord resonans energi-overføring (smFRET) har blitt en utbredt Biofysiske teknikk for å studere dynamikken i biomolecules. For mange molekylær maskiner i en celle proteiner må handle sammen med interaksjon partnere i en funksjonell syklus å oppfylle sin oppgave. Utvidelsen av to-farge til flere smFRET gjør det mulig å samtidig undersøke flere interaksjon eller conformational endres. Dette er ikke bare legger en ny dimensjon til smFRET eksperimenter, men det tilbyr en enestående mulighet til å studere direkte hendelsesforløpet og oppdage korrelert interaksjoner ved en immobilisert prøve og en total intern refleksjon fluorescens mikroskopet (TIRFM). Derfor er multi-farge smFRET et allsidig verktøy for å studere biomolecular komplekser i en kvantitativ måte og i en tidligere uoppnåelig detalj.
Her viser vi hvordan å overvinne de spesielle utfordringene multi-farge smFRET eksperimenter på proteiner. Vi presenterer detaljert protokoller for å skaffe data og trekke ut kinetic. Dette inkluderer spor utvalgskriterier, staten separasjon og utvinning av staten baner fra støyende dataene med en 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Sammenlignet med andre metoder, kinetisk informasjonen ikke er gjenopprettet fra bor tid histogrammer men direkte fra HMM. Maksimal sannsynlighet rammeverket tillater oss å kritisk vurdere kinetic modellen og gi meningsfull usikkerhet for priser.
Ved å bruke vår metode varme sjokk protein 90 (Hsp90), kan vi greie nukleotid bindingen og globale conformational endringer av protein. Dette tillater oss å direkte observere cooperativity mellom to nukleotid bindende lommene på Hsp90-dimer.
Mange proteiner oppfylle sin funksjon dynamisk komplekser med andre molekyler, formidlet av conformational endringer og forbigående foreninger med et bredt spekter av tidsskalaer1,2,3. Koblet til en ekstern energikilde (f.eks ATP) disse dynamiske interaksjoner kan føre til retningen i en funksjonell syklus og til slutt opprettholde ikke-likevekt stabil i en celle, en forutsetning for livet.
For å forstå disse molekylær maskiner, er en statisk beskrivelse av strukturelle studier ikke tilstrekkelig. I tillegg er det viktig å ha kjennskap til den underliggende kinetic modellen og å finne kinetic rate konstanter. Mange eksisterende metoder tillate forskere å studere dynamikken i binær interaksjoner mellom to molekyler av interesse, f.eks overflaten plasmon resonans, avslapning metoder med en spektroskopiske avlesning (f.eks hoppe eller stoppet flyt teknikker), og kjernefysiske magnetisk resonans. Men er deres anvendbarhet oftest begrenset til enkle to-stats systemer (f.eks en bundet og en ubundet tilstand) på grunn av den snitt iboende til bulk eksperimenter. I tilfeller der flere stater eller mellomprodukter er involvert, gir de bare en kompleks blanding av hastighet konstanter. Single-molekylet metoder som optisk eller magnetiske pinsett eller to farger smFRET, dvs. en giver og ett acceptor fluorophore, med en overflate-immobilisert prøve kan gjenopprette rate konstanter for alle observerte conformational endringer. Men når det kommer til interaksjoner påvirker flere binding området, disse metodene er fortsatt begrenset og informasjon om mulig sammenheng av to (eller flere) interaksjoner bare være tilgjengelige via indirekte konklusjoner fra et sett av eksperimenter.
Multi-farge smFRET4,5,6,7,8,9 tilbyr muligheten til å studere samspillet mellom disse komponentene direkte på sanntid og under nær-fysiologiske forhold10. Dette tillater en å undersøke for eksempel konformasjon-avhengige binding av en ligand eller en annen protein8,9,11. Den generelle tilnærmingen presenteres her er å merke protein(s) rundt på bestemte stillinger, knytte en protein på overflaten av måling kammeret og spore fluorescens intensiteten over tid på et prisme-type TIRFM (for detaljer se 9 , 12). romlige nærhet til ulike fargestoffer kan deretter bestemmes fra energi-overføring mellom dem. Merking strategier kan variere fra protein protein (omtalt i 13) og retningslinjer for å unngå gjenstander i smFRET målinger finnes14.
Siden en donor fargestoff kan overføre energi til forskjellige acceptor fargestoffer i et multi-farge smFRET eksperiment, er den relative plasseringen av alle fargestoffer ikke tilgjengelig fra magnetisering av ett fargestoff alene15,16. Men i kombinasjon med vekslende laser eksitasjon (ALEX17og vurdert i 18) denne metoden gir alle spatio-temporale informasjon på sub-sekunders og sub nanometer oppløsning.
Rektor, høy oppløsning strukturinformasjon kan oppnås ved hjelp av Inter fargestoff avstander beregnet ut fra kombinasjonen av alle fluorescens bakgrunnsintensitetene i en multi-farge smFRET eksperimentere med ALEX. Men fokusere her vi på staten identifikasjon og separasjon samt utvinning av kinetic modeller, der multi-farge smFRET er uunnværlig. Når “bare” proteinstrukturer ved triangulering er ønsket, kan et sett med enklere to farger smFRET eksperimenter med høy signal-til-støy-forhold være utført12,19.
Vi bruker den delvis fluorescensen () som en proxy for energi-overføring mellom to fluorophores7. PF beregnes fra fluorescens intensiteten tilsvarende bånd effektiviteten av en tofarget eksperiment:
Der er intensiteten i utslipp kanal em etter eksitasjon med farge ex, og c er acceptor med den lengste bølgelengden. Oppdagelsen kanalene representerer samme posisjon i prøven kammer, men posten forskjellige spectral områder fluorescens lyset. Den samme IDen for eksitasjon og utslipp brukes i denne protokollen (dvs. “blue” “grønn” og “rød”).
På grunn av eksperimentelle mangler av målt fluorescens intensiteten ikke bare på energi-overføring, men også på fluorophore og oppsett. For å få den sanne energieffektiviteten for overføring mellom to fluorophores, må de målte intensiteter korrigeres. Følgende er basert på referanse9. Korreksjonsfaktorer for tilsynelatende lekkasje (Luk, dvs., gjenkjenning av fotoner fra en fluorophore i en kanal dedikert til et annet fargestoff) og tilsynelatende gamma (ag, dvs. fluorescens quantum avkastningen av fargestoff og effektiviteten deteksjon av kanalen) hentes fra single-molekylet spor som viser en godkjenner bleking hendelsen.
Lekkasje av donor fargestoff i hver mulig acceptor kanalen beregnes fra alle datapunktene i innspilte fluorescens spor hvor acceptor fargestoff bleket men giveren er fortsatt fluorescerende ():
Medianen for lekkasje histogrammet brukes som tilsynelatende lekkasje faktoren. Etter korrigering for lekkasje bestemmes tilsynelatende gamma faktoren fra samme sett med spor. Det beregnes ved endring av fluorescens i acceptor kanalen ved endring av fluorescens i donor kanalen ved bleking acceptor fargestoff:
Hvor c igjen er oppdagelsen kanalen for acceptor med den lengste bølgelengden. Medianen til den endelige fordelingen brukes som tilsynelatende korrigeringsfaktoren.
Korrigert intensiteten i hver enkelt kanal oppnås ved:
PF beregnes slik:
Ulike befolkningsgrupper kan skilles i multi-dimensjonale rommet spredt av PF-s. Posisjonen og bredden av hver stat bestemmes ved å tilpasse dataene med multi-dimensjonale Gaussian funksjoner. Etterfølgende optimalisering av en global HMM basert på alle PF spor gir en kvantitativ beskrivelse av den observerte kinetics. Selv små endringer av prisene er synlig.
HMMs er en måte inferring staten modell fra en samling med støyende tid spor. Systemet anses å være i ett av et sett med diskret, skjulte stater til enhver tid og faktiske observasjon (dvs. utslipp) er en sannsynlig funksjon av dette skjult tilstand20. Ved TIRFM smFRET data, kan de utslipp sannsynligheter bjeg per stat jeg modelleres ved kontinuerlig Gaussian sannsynlig tetthet funksjoner. På jevnlig spredte diskret tidspunkt, kan overganger fra én til en annen stat oppstå etter overgangen sannsynlighet som hensyn til tid og bare avhengig av gjeldende status. Overgangen matrix A inneholder disse overgang sannsynligheter enij mellom alle skjulte. Starttilstand distribusjon gir state-spesifikke sannsynlighetene for første gang punktet av en tid sporing. Med en maksimal sannsynlighet tilnærming, kan disse parametrene optimaliseres best beskriver dataene med forover-bakover og Baum-Welch algoritmer20,21. Dette gir maksimal sannsynlighet grunnlaget har (MLE). Endelig kan tilstand sekvensen som mest sannsynlig produsert banen observasjoner konkluderes med Viterbi algoritmen. I motsetning til andre HMM analyser av smFRET data24,25,26 bruker vi ikke HMM som en ren “utjevning” av dataene men utdrag kinetic staten modellen fra datasettet uten behov for å feste holdetiden histogrammer27. HMM analyse er gjort med interne skript ved hjelp av Igor Pro. Implementeringen av koden er basert på referanse21. Vi tilbyr en programvare kit og eksemplarisk data på vår for å kunne følge deler 5 og 6 i denne protokollen (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Full programvare er tilgjengelig på forespørsel.
Tid poeng i dataene med PF < -1 eller PF > 2 i noen oppdagelsen kanalen tilordnes minimale utslipp sannsynligheten for alle stater (10-200). Dette hindrer kunstig overganger på datapunktene.
Parameterne for utslipp sannsynlighetene er Hentet fra passformen til 3D PF histogrammet Gaussian funksjoner som beskrevet i trinn 5.7. Disse parametrene holdes fast i optimalisering av HMM.
I presentert tilnærming brukes starttilstand distribusjon vektoren og overgangen matrisen globalt å beskrive hele ensemblet i spor. De oppdateres basert på alle N molekyler fra datasettet ifølge referanse27.
Startparametere for starttilstand distribusjon bestemmes fra 2D projeksjoner av PF histogrammet (trinn 5.3) og overgang sannsynlighetene er satt til 0,05 med unntak av sannsynlighetene opphold i denne stat, som er valgt slik at sannsynligheten for å forlate en viss tilstand er normalisert Unity.
Sannsynligheten profilering metode brukes til å gi tillit intervaller (CIs) for alle overgang priser21,22, som fungerer som meningsfull estimater for deres usikkerhet. Vil beregne grensene for CI for en bestemt hastighet, er overgang sannsynligheten av interesse festet til en annen verdi enn MLE. Dette gir test modell λ’. En sannsynlighet forholdet (LR) test sannsynlighet gitt datasettet 0 er utført i henhold til:
95% tillit bundet for parameteren er nådd når LR overskrider 3.841, 95% quantile av en x2-distribusjon med en grad av frihet22,23.
Kraften i metoden er demonstrert ved hjelp av Hsp90. Dette rikelig protein i bakterier og eukaryoter og er del av mobilnettet stress respons28. Det er en lovende stoffet mål i kreft behandling29. Hsp90 er en homodimer med en nukleotid binding lomme i N-terminal domene hver delenhet30. Det kan gjennomgå overganger mellom minst to globalt distinkte konformasjonen, en lukket og en N-terminal åpen, V-formet konformasjon19,31,32. Dimeric natur reiser direkte spørsmål om samspillet mellom de to nukleotid bindende områdene i Hsp90.
Nedenfor gir vi en trinnvis protokoll for datainnsamling og analyse av et tre farger smFRET forsøk på gjær Hsp90 og nukleotid. Konformasjon-avhengige binding av fluorescently merket AMP-PNP (AMP-PNP *, en ikke-hydrolyzable analog ATP) er analysert. Programmet beskrevet prosedyren tillater studie av nukleotid bindingen og samtidig conformational forandringene av Hsp90 og avslører dermed cooperativity mellom to nukleotid bindende lommene på Hsp90.
Vi presenterer den eksperimentelle prosedyren for å få tre farger smFRET data for en kompleks protein og en detaljert beskrivelse av analysen av disse målingene. Denne tilnærmingen gir en enestående mulighet til å vurdere sammenhengen mellom flere samhandling nettsteder eller conformational endringer direkte.
For å få egnet multi-farge single-molekylet data på proteiner er det viktig å utføre reproduserbar målinger på lavt støynivå. Dette kan oppnås ved hjelp av en effektiv og …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er finansiert av European forskningsråd gjennom ERC Grant avtalen n. 681891 og tyske Research Foundation (INST 39/969-1).
Setup | |||
vibration-damped optical table | Newport, Irvine, CA, USA | RS2000 | |
OBIS 473nm LX 75mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1185052 | |
OBIS 532nm LS 50mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1261779 | |
OBIS 594nm LS 60mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1233470 | |
OBIS 637nm LX 140mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1196625 | |
laser control unit | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1234465 | Scientific Remote |
aspheric telescope lenses | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | d=25.4mm, f=50mm and f=100mm | |
CF ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 473/10 | cleanup filter excitation |
CF ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 532/10 | cleanup filter excitation |
CF ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 594/10 | cleanup filter excitation |
CF ex4 | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | FL635-10 | cleanup filter excitation |
DM ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ594RDC | dichroic mirror excitation |
DM ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 570DCXR | dichroic mirror excitation |
DM ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ491RDC | dichroic mirror excitation |
AOTFnC-Vis | AA Opto-Electronic, Orsay, France | ||
λ/4 plate | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | AQWP05M-600 | |
CFI Apo TIRF 100x | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | high-NA objective | |
piezo focus positioner MIPOS 250 CAP | piezosystem jena GmbH, Jena, Germany | Piezo Controller NV 40/1 CLE | |
piezo stepper | Newport, Irvine, CA, USA | PZA12 | PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit |
achromatic aspheric lenses | Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany | G322-304-000 | d=50mm, f=200mm |
adjustable optical slit | Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany | 27.160.1212 | max. aperture 12 x 12 mm |
DM det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | T 600 LPXR | dichroic mirror detection |
DM det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | H 560 LPXR superflat | dichroic mirror detection |
DM det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | HC BS R635 | dichroic mirror detection |
BP det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 525/40 BrightLine HC | bandpass filter detection |
BP det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 586/20 BrightLine HC | bandpass filter detection |
BP det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 631/36 BrightLine HC | bandpass filter detection |
BP det4 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 700/75 ET Bandpass | bandpass filter detection |
optical shutters detection | Vincent Associates, Rochester, NY, USA | Uniblitz VS25S2T0 | |
EMCCD iXon Ultra 897 | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | ||
digital I/O card, PCIe-6535 | National Instruments, Austin, Texas, USA | ||
syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD22/2000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow chamber | |||
quartz slides | G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA | Spectrosil2000, h=3mm | |
TEGADERM film | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | 1626W | 10 x 12cm |
spray adhesive | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | Photo Mount 050777 | |
glycerol | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | Immersol G | |
immersion oil | OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany | IMMOIL-F30CC | |
prism | Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany | Suprasil1 | |
aluminium prism holder | custom built | ||
hollow setscrews | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | with custom drilling | |
Tygon S3 E-3603 tubing | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | 2-4450 | ACF00001 |
PTFE tubing | Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany | S1810-08 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sample | |||
yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin | UniProt ID P02829 | ||
Maleimide derivatives of Atto488, Atto550 | ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany | ||
AMP-PNP* | Jena Bioscience, Jena, Germany | γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N | |
Fluospheres | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | F8764 | amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Andor Solis | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | version 4.30 | |
LabVIEW | National Instruments, Austin, Texas, USA | version 2012, 32bit; misc. hardware control | |
MDS control software | AA Opto-Electronic, Orsay, France | version 2.03a | |
Coherent Connection | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | version 3 | |
Igor Pro | WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA | version 6.37 |