3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

많은 단백질 구조적 변화 및 광범위 한 계획^1,2,3과도 연결 하 여 중재 하는 다른 분자와 동적 단지에서 그들의 기능을 충족 해야 합니다. 외부 에너지 원 (예를 들어, ATP) 이러한 동적 상호 작용 기능에서 방향으로 이어질 수 있고 궁극적으로 셀, 인생에 대 한 전제 조건에에서 비 평형 안정 상태를 유지 하는 결합.

완전히 이해 분자 기계, 구조 연구에 의해 유도 정적 설명 충분 하지 않습니다. 또한, 기본 운동 모델의 지식을 하 고 운동 속도 상수를 결정 하기 위해 필수적입니다. 여러 가지 기존 방법을 허용 관심, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 이완 메서드 (예: 점프 또는 중지 흐름 분 광 판독의 2 개의 분자 사이 상호 작용을 바이너리의 역학을 공부 하는 연구원 기술), 및 핵 자기 공명. 그러나, 그들의 적용은 대부분의 경우 간단한 2-상태 시스템 (예를 들어, 하나의 바운드와 언바운드 상태) 평균 하는 대량 실험에 제한. 경우 더 많은 상태 또는 중간체 관련, 그들은 속도 상수만 복잡 한 혼합물을 얻을. 광학 또는 마그네틱 핀셋 또는 2 색 smFRET, 즉, 하나의 기증자 등 표면 움직일 샘플 1 개의 수락자 fluorophore 단일 분자 방법 구조적 변화를 관찰 하는 모든에 대 한 속도 상수를 복구할 수 있습니다. 그러나, 그것은 하나 이상의 바인딩 사이트에 영향을 미치는 상호 작용에 관해서 라면, 이러한 방법을 유지 제한 고 가능한 상관 관계는 2 개 (이상)의 상호 작용에 정보만 실험 집합 간접적 결론을 통해 액세스할 수 있습니다.

실시간에 직접, 및에서 이러한 구성 요소 간의 상호 작용을 공부 하는 기회를 제공 하는 멀티 컬러 smFRET^4,5,6,7,,89 근처 생리 조건¹⁰. 이 하나는 ligand 또는 다른 단백질^8,,911의 구조에 종속적 바인딩 예를 들어 조사를 허용 합니다. 여기에 제시 된 전반적인 접근은 특정 위치, 측정 챔버의 표면에 1 개의 단백질을 연결 하 고 (대 한 자세한 내용은 참조 ⁹ 프리즘 형 TIRFM에 시간이 지남에 형광 강도 추적에 대 한 관심의 protein(s)를 ^{, 12}). 다른 염료의 공간 근접 다음 에너지 전송 그들 사이에서 확인할 수 있습니다. 전략 라벨 다를 수 있습니다 단백질에서 단백질 ( ¹³에서 검토) 및 지침을 smFRET 측정에서 아티팩트를 피하기 위해 존재¹⁴.

이후 기증자 염료 다른 수락자 염료 멀티 컬러 smFRET 실험에서 에너지를 전송할 수 있습니다, 모든 염료의 상대 위치 한 염료 혼자^15,16의 여기에서 액세스가 불가능 합니다. 하지만 레이저 여기 (알렉스¹⁷, 그리고 검토에 ¹⁸) 교체와 함께에서이 방법을 초 및 하위 나노미터의 해상도에서 모든 spatio 시간적 정보를 제공 합니다.

교장, 고해상도 구조 정보 간 염료 거리를 사용 하 여 달성 될 수 있다 알렉스 멀티 컬러 smFRET 실험에서 모든 형광 강렬의 조합에서 계산. 그러나, 여기 우리가에 초점을 어디 다 색 smFRET은 필수 운동 모델의 추출 뿐만 아니라 상태 식별 및 분리. 삼각 측량에 의하여 구조 결심 “만” 원할 때 높은 신호 대 잡음 비율을 간단 하 게 2 색 smFRET 실험의 세트 수행된^12,19될 수 있습니다.

우리가 사용 하는 부분 형광 () 두 fluorophores⁷사이의 에너지 전송에 대 한 프록시로 서. PF 는 2 색 실험의 무서 워 효율 유사한 형광 강도에서 계산 됩니다.

어디, 방출 채널 em 에서 강도 색 전,와 여기 이후 이며 c 는 가장 긴 파장을 가진 수락자. 검색 채널 샘플 챔버 하지만 형광 빛의 기록 다른 스펙트럼 범위에서 동일한 위치를 나타냅니다. 여기 및 방출에 대 한 동일한 식별자가이 프로토콜에 사용 됩니다 (즉, “파랑,” “녹색,” 및 “빨강”).

실험적인 단점 때문에 측정 된 형광 강렬은 에너지 전송에 뿐만 아니라 fluorophore 및 설정 속성에 따라 달라 집니다. 두 fluorophores 사이의 진정한 에너지 전송 효율을 얻기 위하여 측정된 농도 수정 해야 합니다. 다음 절차는 참조⁹를 기반으로 합니다. 명백한 누설 (lk, 즉, 다른 염료에 대 한 지정 된 채널에 fluorophore에서 광자의 탐지) 및 명백한 감마 보정 요인 (ag, 즉, 염료의 형광 양자 수율 및 채널의 검출 효율) 이벤트를 표백 하는 수락자를 표시 하는 단일 분자 추적에서 얻을 수 있습니다.

모든 가능한 수락자 채널에 기증자 염료의 누설은 수락자 염료 표백 하지만 기증자 여전히 형광 기록된 형광 추적에서 모든 데이터 요소에서 계산 ():

누설 히스토그램의 중간값은 명백한 누설 요소로 사용 됩니다. 보정 후 누설에 대 한, 명백한 감마 요소 추적의 동일한 세트에서 결정 됩니다. 그것은 기증자 채널 수락자 염료의 표백 시에 형광의 변화에 의해 수락자 채널에서 형광의 변화를 나누어 계산 됩니다.

여기서 c 는 다시 긴 파장을 가진 수락자에 대 한 감지 채널입니다. 결과 분포의 중앙값 명백한 보정 요소로 사용 됩니다.

각 채널에서 수정 된 농도 의해 얻을 수 있습니다.

PF 는 다음에 따라 계산 됩니다.

다른 인구 PFs에 다차원 공간에서 분리 될 수 있다. 위치와 각 상태의 폭 피팅 다차원 가우스 기능 데이터에 의해 결정 됩니다. 모든 PF 흔적을 기반으로 한 글로벌 흠의 후속 최적화 관찰된 활동의 양적 설명을 제공 합니다. 속도의 심지어 작은 변화는 감지.

HMMs 시끄러운 시간 추적의 컬렉션에서 상태 모델을 유추 하는 방법을 제공 합니다. 시스템은 어떤 주어진된 시간에 실제 관측 (즉, 방출) 숨겨진된 상태는이 숨겨진된 상태²⁰의 확률 함수 이산 집합 중 하나에 있을 여겨진다. TIRFM smFRET 데이터의 경우는 방출 확률 b_나 주 나 당 연속 가우스 확률 밀도 함수에 의해 모델링 될 수 있습니다. 정기적으로 간격 둔된 개별 시간 포인트에서 다른 상태에서 전환 시간 불변 이며만 현재 상태에 따라 전환 확률에 따라 발생할 수 있습니다. 전환 행렬 A 이 전환 확률 _ij 모든 숨겨진된 상태 사이 포함 되어 있습니다. 초기 상태 분포 국가 특정 확률을 제공 시간 추적의 처음으로 포인트. 최대 가능성 접근을 사용 하 여, 가장 앞으로 뒤로 하 고 바 움-웰 치 알고리즘^20,21을 사용 하 여 데이터를 설명 하기 위해 이러한 매개 변수를 최적화할 수 있습니다. 이 최대 가능성 평가 인 (MLE)을 생성합니다. 마지막으로, 가장 가능성이 관측의 궤적 생성 상태 시퀀스 Viterbi 알고리즘 유추 수 있습니다. SmFRET 데이터^24,,2526 의 다른 흠 분석 달리 우리가 사용 하지 않는 한 단순한 “부드럽게” 데이터 하지만 필요 없이 데이터 집합에서 추출 운동 상태 모델의 피팅 유지 시간으로 흠 히스토그램²⁷ 흠 분석 자체 스크립트 이고르 프로 사용 하 여 이루어집니다. 코드의 구현은 참조²¹을 기반으로 합니다. 제공 하는 소프트웨어 키트 모범적인 데이터 우리의 웹 페이지에 따라 섹션 5와 6이이 프로토콜 (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret)의 순서. 전체 소프트웨어는 요청 시 이용 가능.

PF 데이터에서 포인트 시간 <-1 또는 PF > 2 어떤 검색 채널에 모든 국가 (10^-200)에 대 한 최소한의 방출 확률 할당 됩니다. 이러한 데이터 요소에 인공 전환이 되지 않습니다.

5.7 단계에서 설명한 대로 방출 확률에 대 한 매개 변수 가우스 기능 3D PF 히스토그램의 적합에서 얻을 수 있습니다. 이 매개 변수는 흠의 최적화 하는 동안 고정 유지 됩니다.

제시 방법에서 초기 상태로 배포 벡터와 전환 매트릭스 사용 됩니다 세계적으로 추적의 전체 앙상블을 설명 하. 그들은 참조²⁷에 따라 데이터 집합에서 모든 N 분자에 따라 업데이트 됩니다.

초기 상태 분포에 대 한 시작 매개 변수 (단계 5.3) PF 히스토그램의 2D 계획에서 결정 됩니다 고 전환 확률 설정 됩니다 확률 제외 0.05 동일한 상태를 유지 하기 등을 선택 하는 특정 상태를 두고 확률 화합과 정규화 됩니다.

가능성 프로 파일링 방법 모든 전환 속도^21,22, 그들의 불확실성에 대 한 의미 있는 견적으로 봉사 하는 자신감을 간격 (CIs)에 게 하는 데 사용 됩니다. 특정 비율에 대 한 CI의 범위를 계산 하려면 전환 확률의 MLE 이외의 값으로 고정 됩니다. 이 테스트 모델 λ 생성 ‘. 가능성의 가능성 비율 (LR) 테스트 데이터 집합 주어진 0 에 따라 수행 됩니다.

바인딩된 매개 변수 LR 3.841는 x²의 95% 논집을 초과 하는 경우에 도달 하면에 대 한 95% 신뢰-한 자유도^22,23분포.

방법의 파워는 Hsp90를 사용 하 여 증명 됩니다. 풍부한 단백질이 박테리아 및 진핵생물에서 발견 되 고 세포질 긴장 응답²⁸의 일부입니다. 그것은 암 치료²⁹유망 약 대상입니다. Hsp90 homodimer 각 소 단위³⁰의 N 맨끝 도메인에 하나의 뉴클레오티드 바인딩 포켓입니다. 그것은 적어도 두 개의 전역 고유 conformations, 폐쇄 하나 하나의 N-터미널 오픈, V 자형 구조^19,31,32사이 영상 효과 받을 수 있습니다. 직접 dimeric 자연 Hsp90에 두 개의 뉴클레오티드 바인딩 사이트 사이 상호 작용의 문제를 발생 시킵니다.

다음에, 우리는 데이터 수집 및 효 모 Hsp90 그리고 뉴클레오티드에 3 색 smFRET 실험의 분석에 대 한 단계별 프로토콜을 제공. 붙일 레이블 앰프 PNP의 구조에 종속적 바인딩 (앰프 PNP *, ATP의 비 hydrolyzable 아날로그) 분석 된다. 설명 된 절차의 응용 프로그램 허용 뉴클레오티드 바인딩 및 동시에 연구 Hsp90의 구조적 변화 하 고 그로 인하여 Hsp90의 2 개의 뉴클레오티드 바인딩 포켓 사이 cooperativity를 보여준다.