마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

모든 프로토콜 및 동물 주제에 사용 되는 방법 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 타이베이 의학 대학에 의해 승인 되었습니다 (번호를 프로토콜: 락-2013-0278; LAC-2015-0397) 1. 기본 신경 문화 문화 전에 준비 폴 리-D-리 (표 1)와 문화 요리 문화 전에 1 일 코트. 6-잘 접시에 대 한 각 우물에 1.5 mL 폴 리-D-리 (0.05 mg/mL)을 추가 합니다. 라이브 영상에 대 한 표준 코팅된 6 잘 플레이트에 12 m m x 12 m m coverslip 셀 문화. 제거/재활용 폴 리-D-리 신 및 2 mL ddH2오로 두 번 설거지 수술 도구 준비: 마이크로 해 부가 위, 집게 곡선 밀고 및 표준 똑바로 밀고 집게의 쌍. 수술 도구를 소독 하 고 수술 하는 동안 75% 에탄올에 그들을 유지. 20 mL 세척 매체 (표 1)와 10 cm 배양 접시를 얼음에 계속. 15 mL 세척 매체와 15 mL 테스트 튜브를 얼음에 튜브를 유지. 서로 다른 뇌 영역에서 뇌 조직 분리 비 풍에 마우스를 놓고 다음 공동2중독 표준 euthanization 프로토콜 16-19 일 이전 임신 여성 쥐를 희생. E15.5 ~ E16.5 배아 hypothalamic 신경 문화 및 E16.5에 대 한 권장 ~ E17.5 hippocampal 및 대뇌 피 질의 신경 문화에 대 한 더 적당 하다. 플랫폼, 해 현미경 및 오염을 피하기 위하여 75% 에탄올과 수술 도구를 소독. (그림 1C, 1d) 손상 없이 쉽게 (어두운 빨간색 영역, 그림 1A, 1B 대시 선) 새끼를 격리 탯 주변 잘라. 가 위 (그림 1E, F)와 함께 각 강아지의 머리 부분을 제거 후 눈 영역 (그림 1G)에 대 한 뾰족한 스트레이트 집게를 사용 하는 장소에서 머리 부분을 보호. 사용 다른 뾰족한 곡선 두 가지 측면에서 외부 피부와 두개골을 제거 하 고 등 쪽 방향으로 (그림 1 H, 검은 화살표 방향에 포인트) 앞쪽에서 그들을 껍질을 집게. 뇌 손상 (그림 1I) 없이 격리 되어야 합니다.참고: 두뇌의 다른 지구를 분리 하는 경우 정확도 보장 하기 위해 뇌의 무결성을 유지 하기 위해 필수적 이다. 다음 단계에 대 한 차가운 세척 매체와 깨끗 한 페 트리 접시에 고립 된 두뇌를 유지. 두뇌를 플립 하 고 복 부 측면을 유지. 시상 하 부 뇌 (그림 1J, hypothalamic 지역에 화살표 포인트)의 한가운데에 둥근 구조 이다. 뾰족한 곡선된 겸 자와 hypothalamic 조직 분리. (이 노란 레드 색상) meninges 제거 신중 하 게.주의: meninges의 완전 한 제거 섬유 오염 방지 하려면 중요 한 단계입니다. 날카로운 집게와 후 엽 고 곡선된 겸 자 (그림 1 K, L)와 함께 전체 뇌를 둘러싼 얇은 meninges 벗기다. 해 마는 바나나 모양 피 아래 부분에 포함 되는 이다. 외피의 밑면에 튀기 십시오 그리고 곡선된 겸 자 (그림 1 MN, 및 O)와 측면을 당겨 피 질에서 해 마를 분리. 모든 나머지 meninges 주변 뇌 조직의 제거를 해야 합니다. 두뇌의 모든 지역 고립 되었을 때, 집게 (단계 1.1.5)의 도움으로 얼음 처럼 차가운 세척 매체를 포함 하는 15 mL 튜브에이 조직 들어온다.참고: 뇌 조직은 2-3 h에 대 한 차가운 세척 매체에 보관할 수 있습니다. 조직 소화, 도금 및 문화 반전 조직 포함 된 15 mL 튜브, 2-3 시간 여 조직을 헹 구 고 튜브 (1-3 분) 정착 조직 수 있도록 똑바로 유지. 상단 중간 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 진공 시스템에 연결 된 제거. 조직, 씻어 15 mL 얼음 차가운 세척 매체를 추가 하 고 반전 튜브 2-3 번. 다음 단계 전에 3 번 세척 단계를 반복 합니다.주의: 위 매체는 진공 시스템을 사용 하 여 제거할 때 바닥에 직물의 주의 해야 합니다. 최종 세척 후 세척 매체 1 mL 피 펫의 도움으로 제거 합니다. Papain 트립 신 소화 버퍼 (표 1) 7 월 14 일 분 쉐이크에 대 한 37 ° C 물 욕조에 조직 되도록 모든 조직 마다 두 분 제대로 소화 버퍼에 노출 되는 튜브를 품 어.참고: 보육 시간 및 소화 버퍼의 양을 조정할 수 있습니다 조직 크기에 따라. 6-8 새끼에서 수집 hypothalamic 조직, 300 µ L Papain 트립 신 소화 버퍼와 7 분 보육 시간 것이 좋습니다. 더 많은 조직 더 소화 버퍼를 요구할 것 이다. 소 태아 혈 청의 1 볼륨을 추가 하 여 효소의 활동을 무력화. 실 온에서 3-5 회 테스트 튜브 흔들. 선반에 튜브를 유지 하 고 정착; 조직 수 있도록 1-2 분 기다립니다 1 mL 피 펫으로 신중 하 게 상쾌한을 제거 합니다. 6 mL 도금 매체 (표 1) 테스트 튜브 및 피펫으로 위아래 조직에 50 시간 5 mL 피 펫 부드럽게 (대 6-잘 접시, 잘 당 1.5 mL 도금 매체 권장)를 추가 합니다. 대부분의 세포 pipetting 반복 후 단일 세포로 분리 됩니다.참고:이 단계를 수행 하는 동안 거품의 형성을 방지 하려고 합니다. 대부분 실험실 염증이 유리 목장 pipets를 사용 하 여 조직의 해리. 좁은 팁 5 mL 피 펫이이 단계에 대 한 좋은 대안이 될 수 있습니다. 선반에는 튜브를 유지 하 고 정착 chunky, 유엔 천연 조직 수 있도록 1-2 분 기다립니다. 위 단계를 포함 하는 새로운 튜브에 세포를 해리와 매체 (해리 셀의 1 x 볼륨 당 볼륨 도금 매체 x 5 도금을 희석. 예를 들어 5 mL 매체 1 mL 해리 셀에 대 한 도금 추가). hemocytometer를 사용 하 여 셀 밀도 계산 하 고 폴 리-D-리 신 단계 1.1.1에서 코팅 문화 접시에 셀의 필요한 수를 시드하십시오. 2-4 x 6 잘 접시/35 m m 음식에 대 한 잘 당 105 세포 이미징 연구 하는 신경에 대 한 권장 하는 것이 좋습니다. 높은 밀도 단백질 수집 및 분석을 위해 필요할.참고: 추가 하지 마십시오 너무 많은 도금 매체 한 6-잘 접시에 1-1.5 mL 도금 매체는 첨부 파일에 대 한 충분 한. 매체의 과도 한 양의 적절 한 세포 부착에 필요한 시간을 연장할 것 이다. 2-3 h 기다립니다 고 현미경 시드 뉴런을 확인 합니다. 신경 그들은 제대로 연결 신경 염을 성장 하기 시작 합니다. 도금 매체를 제거 하 고 도금 매체를 씻어 접시에 따뜻하게 2 mL 세척 매체 (37 ° C)를 추가 합니다. 이 단계를 두 번 반복 합니다. 6-잘 접시에 각 음에 2 mL 전체 문화 매체 (표 1)를 추가 합니다. 매체의 절반 매 3-4 일 변경. 완전 한 매체 준비 갓 각 시간. 다른 마우스 두뇌 지역에서 경작 하는 신경 세포는 다른 형태 및 특성 (그림 2) 있을 것 이다. 2. 플라스 미드 DNA의 transfection Liposome 시스템 기본 신경으로 주의: 신경 세포 transfection, 위해도 무료 플라스 미드 DNA 정제 키트 (자료 테이블) DNA 준비를 위해 추천 된다. 추가 에탄올 강수량 초과 용 매를 제거할 수 있습니다 고 DNA 농도 향상 시킵니다. Liposome 기반 기본 신경 세포에서 DNA transfection입니다.참고: transfection 시간 실험에 필요한 성숙 상태에 따라 달라 집니다. Hypothalamic 뉴런 DIV 7-10 (DIV, 일 체 외)에서 페 했다. DNA: Liposome 혼합물 준비: 희석 GFP GLUT4 플라스 미드 DNA16 (2 µ g)는 microcentrifuge에서 튜브 포함 300 µ L 낮은 혈 청 문화 매체. 300 µ L 낮은 혈 청 문화 매체에서 2 µ L liposome와 다른 microcentrifuge 튜브를 준비 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어. 두 튜브의 내용을 결합 하 고 실 온에서 20-30 분 동안 품 어. 문화 요리에서 신경 문화 매체를 제거 합니다. 각 우물에 600 µ L DNA liposome 혼합물을 추가 하 고 4-6 h 37 ° C에서 품 어. 4-6 h 후 DNA liposome 혼합물을 제거 하 고 2 mL 문화 매체를 추가 합니다. 18-72 h 후 혼자 GFP 등 GLUT4 단백질 GFP 태그 (그림 3 및 그림 4)와 함께 활용 된 형광 신호를 관찰할 수 있습니다. 3. 라이브 이미지 기록 에 대 한 준비 셀 라이브 영상 WT CCR5-/- hypothalamic 신경 세포 포도 당 운송업 자 4 (GFP GLUT4) #1.5 (또는 0.17 m m 두께)에 표시 하는 녹색 형광 단백질을 표현 문화 유리 coverslip 폴 리-D-리 6-잘에서 1.1.1 단계에서 미리 코팅 되었습니다 플레이트입니다. 조심 스럽게 집게를 사용 하 여 신경 세포와는 coverslips를 제거 하 고 주의 유리 슬라이드에 배치. 섬세 한 작업 잎사귀와 초과 매체/액체를 제거 합니다. 잎사귀를 두 번 접어 그리고 신중 하 게는 coverslip 위에 그들을 배치. 부드럽게는 coverslip 이동 하지 않고 잎사귀 아래로 누릅니다.주의: 유리 슬라이드에 coverslip을 강제로 누르지 마십시오. 이 단계의 목적은 보장 하는 coverslip 않습니다 하지 이동/드리프트 이미지 중 부 력 힘으로 인 한 것입니다. Coverslips 및 슬라이드에 배치 deconvolution 현미경 단계 coverslip 연결, 그리고 보안을 제대로. 이 단계는 사용자가 나중에 대상 셀의 동일한 집합을 추적할 수 있도록 슬라이드 위치 계속 유지 되도록. WT CCR5-/- hypothalamic 신경 세포 60 x 관찰 / 1.42 나 기름 침수 렌즈. CCL5와 선택한 셀 샘플을 치료 (10 ng/mL) 또는 희석된 인슐린 coverslip의 가장자리에의 한 분 추가 1.5 µ L에 대 한 인슐린 (10 U/mL). 시각화 하 고 즉시 선택한 셀 샘플을 기록 합니다. 30 분 동안 녹화 비디오 기록 소프트웨어 프로그램입니다. Deconvolution 현미경 및 분석참고: 분석에 대 한 프로토콜의이 부분에서 deconvolution 현미경 및 특수 소프트웨어의 사용을 해야합니다. 이미징 시스템의 전원을 켭니다, 그리고 제대로 초기화 하 다음 LED 광원 현미경 단계를 수 있습니다. 60 x 1.42 나 대물 렌즈에 침수 기름 (굴절률 1.520 37 ° C에서 라이브 샘플에 대 한)를 추가 합니다. 샘플 슬라이드에 현미경 대물 렌즈 쪽으로 직면 하는 coverslip로 놓고 슬라이드를 제대로 확보. 밝은 분야 또는 형광 조명 사용 하 여 대상 셀을 식별. 대상 셀을 명확 하 게 관찰 될 수 있다 때까지 초점을 조정 합니다. 영역 외부에 coverslip 불필요 한 긁힌 자국을 피하기 위해 대물 렌즈를 이동 하지 마십시오. 식별 녹색 형광 단백질 GFP 신호에 의해 포도 당 운송업 자 4 (GFP GLUT4) 활용. 이미지 수집에 대 한 원하는 대상 셀을 식별 합니다. 선택한 대상 셀 위치 나중에 참조할 수 (그림 4)에 대 한 기억 될 수 있습니다. 적절 한 실험 매개 변수 (를 포함 하 여 픽셀 수, 여기 파장, 전송 비율, 노출 시간, 스택 두께, 시간 간격, 및 총 영상 시간) 각 대상 셀에 설치. 이 실험에 대 한 이미지 픽셀 수 512 x 512 (그것에서 설정할 수 있습니다 높은 해상도 1024 x 1024)에서 GFP 신호 설정 했다. 노출 시간 0.025 0.05 s 마다 5 분 사소한 측면 x, y, 및 z 조정에 대 한 권장된 소프트웨어 (자료 테이블)에 의해 통제 될 수 있다 사이 설정 했다. 최대 픽셀 강도 달성 하기 위해 약 3000 2000 카운트를 노출 매개 변수를 설정 합니다. 유지 노출 시간 1 s. 반복 각 추가 형광 채널 및 관심의 각 개별 영역에 대 한 다음이 단계 동안 형광 photobleaching를 최소화 하기 위해 여기 광선 전송 가능한 만큼의 비율을 줄일 수 있습니다. 각 대상 셀에 Z-스택의 위와 더 낮은 한계를 설정. 이 때까지 목표 셀의 위아래 모두 초점이 약간 현미경 단계를 이동 하 여 얻을 수 있습니다. 사용자는 상위 및 하위 제한 (각 이미지 사이의 거리를 설정 하 여 할 수 있습니다) 사이의 이미지의 수를 설정 하 여 z 축 해상도 조정할 수 있습니다. 이미지의 deconvolved 그리고 나중이 경우에 각각 소프트웨어-엘머에서 속도의 도움으로 분석 했다.