이 프로토콜 개발 인간의 두뇌의 Zika 바이러스 감염을 모델링 하는 데 사용 되는 기술을 설명 합니다. Wildtype 또는 설계 된 줄기 세포를 사용 하 여, 연구원은 다양 한 메커니즘 또는 초기 뇌 감염 및 결과 microcephaly Zika 바이러스에 감염 된 태아에 영향을 미칠 수 있는 치료를 밝히기 위해이 기술을 사용할 수 있습니다.
취약 인구에 Zika 바이러스 (ZIKV)의 최근 출현 microcephaly 갑작스러운 증가 및에 다른 neurodevelopmental 신생아 유아에서 주도하 고 있다. 모기는 바이러스 성 전송의 주요 경로, 그것은 또한 성적 접촉 및 수직 어머니 태아 전송을 통해 확산 하기 위해 표시 되었습니다. 전송, ZIKV의 독특한 바이러스 성 차 있는 굴곡 운동으로이 후자의 경우에 바이러스는 개발 두뇌의 신경 조상 세포 (Npc) 주로 대상으로 생각 됩니다.
여기 ZIKV 감염, 그리고 결과 microcephaly 모델링 하는 방법, 그 때 발생 인간의 대뇌 organoids 노출 되는 ZIKV 사는 설명 합니다. organoids 그들의 신경 조상 인구 내에서 바이러스의 높은 레벨을 표시 하 고 시간이 지남에 심각한 세포 죽음과 microcephaly 전시. 이 3 차원 뇌 organoid 모델을 관찰 하 고 잠재적으로 개발 인간의 두뇌의 ZIKV 감염으로 개입 종 일치 하는 실험을 실시 연구자 수 있습니다. 모델 표준 2 차원 방법, 향상 된 관련성을 제공 하 고 인간의 특정 세포질 건축 및 동물 모델에서 가능 하지 않은 단백질 식 포함.
Zika 바이러스 (ZIKV) 미크로네시아, 프랑스령 폴리네시아, 아메리카에서 빠르게 확산 하고있다 그리고 neurodevelopmental 질병 등으로 이어지는 개발 태아 두뇌 감염 placental 방 벽1,2 를 보여왔다 최근 microcephaly3,,45,6 으로. 이 환자의 삶과 치료의 현재 부족에 장기 영향 연구자와 임상 ZIKV 감염 및 복제 메커니즘의 더 나은 이해를 위해 출 격을 주도하 고 있다. 이전 학문 생체 외에서 순수 관련 셀 유형7,8,9, vivo에서10 의 다양 한 시스템의 ZIKV 감염 검사 immunocompetent immunocompromised 마우스11,,1213 그리고 비 인간 영장류14,,1516. 이러한 전통적인 기법 뿐만 아니라 여러 그룹 개발 인간의 두뇌의 ZIKV 감염에 대 한 자세한 이해를 대뇌 organoids 줄기 세포 유래를 구현 했습니다. 이 그룹 microcephaly 형17,18확인, 바이러스 항목19에 연결 된 수용 체를 조사, 감염20 생리 적인 응답을 검사 하는 인간의 대뇌 organoids 활용 , 21, 그리고 잠재적으로 약물 후보22화면. 여기 신속 하 게 생성 하 고 줄기 세포 파생 대뇌 organoids 감염에 대 한 기술 같이 이전19, 개발 인간의 두뇌의 ZIKV 감염의 이해를 개선 하기, 설명 되어 있습니다.
때문에 organoids 표준 만능 줄기 세포 (PSC) 문화에서 형성 된다,이 기술은 개발 두뇌의 바이러스 감염에 관한 답변 다양 한 과학적 질문에 대 한 수 있습니다. 예를 들어 CRISPR 공학 대부분 vivo에서 유전자 연구19보다 더 빠른 속도로 organoid 감염 전에이 PSC 라인 수정에 사용할 수 있습니다. 또한, 달리 표준 2 차원 (2D) 차별화 문화, organoids corticogenesis에 대 한 중요 한 복잡 한 세포 구조 전시 및 최근 연구는이 아키텍처는 감염 시 중단 될 수 있습니다. 21. 마지막으로, 상대적으로 저렴 한 비용 organoids 생성의 더 높은 처리량 실험 및 검사 vivo에서 모델에 비해 있습니다. 다른 한편으로, organoids ZIKV을 공부에 활용 하는 몇 가지 단점이 있다. Organoids 2D 문화 보다 훨씬 더 생물학적으로 관련 있는 동안, 그들의 3 차원 (3D) 특성상 organoids의 평가에서 추가 도전이 있다. 이미징 및 organoids의 분리는 더 많은 장비와 표준 2D 문화에 보다 자원의 더 큰 투자 하 경향이 있다. 또한, organoids 부족 맥 관 구조 및 면역학 구성 요소에에서 존재 하는 비보에 모델, 그래서 연구원은 바이러스 성 감염의 그 측면에 관심이 대체 프로토콜을 추구 하도록 조언 된다.
인간 organoids 및 문화, neurospheres의 형성에 대 한 기술의 수 있다 그리고 그들은 일반적으로 패턴화 또는 총칭 범주 내에서을. 패턴화 방법 요소 특정 계보23으로 차별화를 밀어 Wnt, BMP, TGFβ, 및 다른 신호 경로를 구현 합니다. 총칭된 방법, 여기에 설명 된 것과 같은 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 성향 활용 하 고 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)으로 neuroectodermal 혈통으로 차별화 하는 데 기본24. 약 3 주 후 차별화, 초기 개발 두뇌에서 관찰 되는 여러 셀 형식을 포함 하는 큰, biomimetic neuroepithelial 구조 결과 organoids에 의하여 이루어져 있다.
기술 표준, 피더 무료 PSC 문화에서 organoids를 생성 하 고 ZIKV와이 organoids이 감염에 대 한 전체에 표시 됩니다. 급지대 무료 PSCs 필요 자란 방법에 대 한 지침, 이전 방법 간행물25,26를 참조 하십시오. 또한, 여러 실험에 대 한 바이러스의 일관 된 금액을 적용, 그것은 미리 나를 계산 하는 것이 중요. 이 Vero 세포, 오버레이 매체, 인큐베이션, immunostaining와 치료 뒤의 감염을 실시 하 여 이루어집니다. 이 기술의 방법과 설명 앞에서 설명한19,27되었습니다.
PSC 문화에 도달 하면 대상 합류 50%-70%의 세포는 해리 그리고 낮은 첨부 파일 96 잘 접시로 집계 합니다. 셀 줄기 세포 이종 무료 유지 보수 미디어 (SCMM), 3 일 동안 유지 되며 다음 문화권의 나머지 부분에 대 한 신경 유도 미디어로 변환. Organoids는 3 주 동안 분화는, 일단 감염을 수행할 수 있습니다. 정기적으로 복용 함으로써 이미지 감염 다음 주 동안, 연구원은 진보적인 세포 죽음과 organoid의 관찰할 것입니다. 연구원은 또한이 transcriptional 실시 시간 또는 proteomic 프로 파일링에 organoids을 분열 수 있습니다. 이미징, Cryosectioning 및 lightsheet 메서드는 권장 하 고 연구원은 감염 및 신경 조상 세포 (NPC) 인구는 organoids에서 내 특히 바이러스 성 복제의 높은 수준의 볼 기대할 수 있습니다. 궁극적으로,이 기술은 신속 하 게 저렴 한 비용 및 제한 된 장비와 인간 두뇌의 바이러스 감염의 메커니즘을 검토 하는 연구를 수 있습니다.
인간의 대뇌 organoids를 활용 하면 ZIKV 감염 조사를 고려해 야 할 몇 가지 경고가 있다. 한 가지 중요 한 고려 사항은 그 organoid 형성 이며 구조는 매우 그들이 형성 하는 줄기 세포 라인에 의존. 셀 라인 사이 비교 주의 isogenic를 포함 하 여 설계 라인; 그것은 최고의 여러 subclones, 그리고 이상적으로 여러 줄기 세포 라인을 사용 하 여 결론을 확인 하는. 또한 셀 라인에이 차이로 인해 파일럿 실험 적절 한 차별화는 organoids에서 발생 되도록 것이 좋습니다. Neuroepithelial 구조는 명시 야 현미경으로 볼 수 있습니다, 하는 동안 그것은 또한 신경 분화 마커 PAX6 등 인 vimentin 찾아 qRT-PCR 또는 cryosectioning 실험을 실시 권장 됩니다.
하나는 또한 동일한 셀 라인에서 organoids 사이에서 상당한 변화를 예상 해야 합니다. 프로토콜의 총칭 특성상 수와 neuroepithelial 구조체의 크기는 개별 organoids 사이 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 하나 적어도 2을 큰 기대할 수 있습니다 (> D24 직경에 200 µ m) 당 organoid 신경 근 엽. 이러한 이유로, 감염, 따라 organoid 크기에서 변화의 관찰 등 경도 연구는 특히 계몽. 배치 사이 가변성 발생할 수 있습니다 또한,이 대 한 가장 큰 원인은와 부정확 한 셀 계산 또는 시드. 여러 계산을 수행 하 고 셀 서 스 펜 션은 울 라 U-하단 96 잘 접시에 뿌리기 전에 잘 혼합 되도록 하는 것이 좋습니다.
Organoids 울 라 U-하단 96 잘 접시에서 배양 때 플레이트의 가장자리 주위 상당한 증발 효과 보는에 계획 한다. PBS이 웰이 스 작성 및 센터 60 우물 에서만 작동 이상적 이다. 증발, 인해 외부 우물에서 organoids 보다 가능성이 그들의 성장과 분화에 영향을 미칠 것입니다 중앙에 서로 다른 조건에 노출 됩니다. 실험에 필요한 것입니다 organoids의 수를 계획할 때이 고려 하시기 바랍니다. 또한, organoids 문화 매체의 변색 표시 될 것입니다 약 30 일 후 96 잘 포맷을 자라 다 시작 됩니다. 지난 30 일 organoids에 계획 하는 경우는 organoids 울 라 24-잘 접시에 전송 하는 것이 좋습니다. 전송을 수행 하려면 오프닝, organoids 보다 훨씬 큽니다 P1000 팁을 잘라가 위를 사용 하 여 고 pipetting으로 organoids 전송.
인간의 대뇌 organoids neurodevelopment 및 질병의 필드의 이해에 큰 잠재력을 보유. 연구원은 필요에 따라 프로토콜을 수정 하는 것이 좋습니다. 예를 들어 하나의 특정 해 부 지역에 바이러스 영향을 탐구 있도록 특정 세포 유형으로 분화 효율을 향상 시키기 위해 패턴 요소 구현 수 있습니다. ZIKV의 neurodevelopmental 효과 여전히 제대로 이해 하 고, 그러나이 새로운 방법은 연구자에 게 감염의 메커니즘을 조사 하는 데 액세스할 수, 빠른, 및 높은 처리량 방법을 줄 것 이다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 초기 전파 및 ZIKV의 정량화에 대 한 프리 실라 나 양 및 하버드의과 대학의 도미니크 제이 자가 감사합니다. 우리 또한 이미징 지원에 대 한 나 다니엘 디 캠프를 감사 하 고 싶습니다. K.E. 정신과 연구와 하버드 대학 줄기 세포 연구소 스탠리 센터에 의해 지원 되었다.
Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 | StemCell Technologies | 5940 | Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton. Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components |
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase | Gibco | A11105-01 | Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary |
Y-27632 | Selleck Chem | S1049 | Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
Heparin | Sigma-Adrich | H4784-1G | Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |