En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

Enfermedades priónicas o encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Creutzfeldt – Jakob (ECJ) en humanos, la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en bovinos, scrapie en ovejas y cabras y emaciación crónica enfermedad (CWD) en cérvidos ^1,2. Las EET se caracterizan por la apariencia espongiforme distintivo y pérdida de neuronas en el cerebro. Según la hipótesis de “sólo proteína”, priones están compuestos principalmente de PrP^Sc (‘Sc’ para scrapie) ³, una isoforma mal plegada de la proteína priónica celular codificada en host, PrP^C. PrP^Sc resulta de la transformación de PrP^C en una conformación enriquecida en hojas de ᵦ ^4,5,6 que puede actuar como una semilla para enlazar y convertir otras moléculas de PrP^C . Las moléculas de PrP^Sc recién generadas se incorporan en un crecimiento polímero ^7,8 se rompe en pequeños oligómeros, dando por resultado un número mayor de núcleos infecciosos. PrP^Sc es propensa a la agregación y es parcialmente resistente a proteasas ^9,10.

CWD afecta salvajes y cultivados elk (Cervus canadensis), venado bura (Odocoileus hemionus), venado de cola blanca (DMT; Odocoileus virginianus), alces (Alces alces) y renos (Rangifer tarandus tarandus) ^11,12,13. Se considera la enfermedad más contagiosa del prión con transmisión horizontal favorecida por las interacciones de cérvidos y persistencia ambiental de infectividad ^14,15. A diferencia de otras enfermedades priónicas en acumulación de PrP^Sc e infectividad se limitan al cerebro, en CWD estos también se encuentran en tejidos periféricos y fluidos corporales por ejemplo, saliva, orina y heces ^{16,17, 18}.

Inmunohistoquímica se considera el estándar de oro para el diagnóstico CWD detectar PrP^Sc distribución y espongiforme lesiones ^19,20. ELISA y en más raras ocasiones, mancha blanca /negra occidental también se utilizan para el diagnóstico CWD. Así, diagnóstico de enfermedades priónicas actual se basa principalmente en la detección de priones en tejidos post-mortem. El diagnóstico ante mortem para CWD está disponible tomando las amígdalas o biopsias de tejido linfoide asociado a mucosa recto-anal (RAMALT); sin embargo, este procedimiento es invasivo y requiere la captura de los animales. Así, el uso de muestras de fácil acceso, como la orina y las heces, sería una manera práctica para la detección de priones CWD. Sin embargo, esos puerto de excretas relativamente bajas concentraciones de priones por debajo del límite de detección actuales de métodos de diagnóstico. Por lo tanto, es necesaria una más sensible y de alto rendimiento herramienta de diagnóstico. In vitro sistemas de conversión, tales como proteína mal plegamiento de amplificación cíclica del análisis (EPCP) ²¹, amiloide siembra ensayo y conversión inducida por el temblor en tiempo real (RT-QuIC) ensayo ^{22,23, 24} son herramientas muy poderosas para explotar la capacidad uno mismo-propagación de PrP^Sc para imitar en vitro el proceso de conversión del prión y así ampliar la presencia de cantidades minuciosas de PrP^Sc a niveles detectables ^{25 ,26}. El método de RT-QuIC, sin embargo, aprovecha el hecho de que el producto de conversión enriquecido en β-hoja estructura secundaria puede atar específicamente tioflavina T (Th-T). Por lo tanto, PrP recombinante (formará) sobre conversión de semilla crece en las fibrillas amiloideas que Th-T se unen y así se pueden detectar en tiempo real midiendo la fluorescencia del Th-T expresada en unidades de fluorescencia relativa (RFU) con el tiempo. Una vez controlados, la RFU puede utilizarse para evaluar actividades siembra relativa y parámetros cuantitativos como la fase lag. La fase de retraso representa el tiempo (h) necesario para alcanzar el umbral, durante que formará la conversión en la etapa temprana de la reacción es por debajo del límite de detección de fluorescencia Th-T. Al final de la fase de retraso evidente, concomitante a la formación de un núcleo de amiloide suficiente (carga/alargamiento), ocurre cuando la fluorescencia Th-T supera el nivel umbral y se convierte en positivo. El crecimiento de amiloide fibrillas se pueden detectar en tiempo real y la inicial de PrP^Sc o siembra actividad contenida en la muestra es amplificado por la segmentación que genera más semillas. Estas semillas a su vez inducen una rápida fase exponencial de crecimiento de la fibra amiloide.

Debido a que este análisis sean capaz de detectar tan bajo como 1 fg de PrP^{Sc 24}, la alta sensibilidad califica esta técnica para lograr ante mortem o diagnóstico no invasivo mediante la detección de PrP^Sc en diversos tejidos periféricos, excretas u otros tipo de muestra que los bajos niveles de infectividad. RT-QuIC definitivamente proporciona ventajas sobre otros ensayos para su reproducibilidad, practicidad, rapidez (menos de 50 h) y bajos costos en comparación a las pruebas biológicas. Evita las complejidades técnicas como sonicación en EPCP; también, se realiza en una microplaca de cinta de sellado que minimiza el riesgo de contaminación de aerosoles de cada pozo. El formato multi-bien permite el análisis de hasta 96 muestras en el mismo experimento. Para contrarrestar el problema recurrente de los falsos positivos y la conversión espontánea de formará en los ensayos de conversión en vitro es muy útil la aplicación de un umbral (corte) en RT-QuIC. De hecho, basándose en los resultados del control negativo (RFU promedio de muestras negativas + 5 SD ²⁷), una línea de base se establece que se puede hacer discriminación entre muestras positivas y negativas. El uso de cuatro repeticiones para cada muestra así puede ayudar a definir una muestra como positiva cuando al menos el 50% de las repeticiones muestran una señal positiva, es decir, cruzar el corte ²⁸. La homología entre la semilla y el substrato no es necesaria en RT-QuIC, como por ejemplo en un estudio anterior, formará hámster fue encontrado ser un sustrato más sensible en comparación con el sustrato homólogo en humanos de PrP^ECJv sin semillas y scrapie ovino sembrado reacciones ²⁹. oveja hámster quimérica formará también sugirió que un sustrato más adecuado que formará humana para la detección de priones ECJ variante humana ³⁰. Por lo tanto, la utilización de sustratos formará de distintas especies es muy común en este ensayo. Este ensayo se ha aplicado con éxito a varias enfermedades del prión como la esporádica CJD ^31,32,33, genenfermedades de prion ETIC ³⁴, EEB ^35,36,37, tembladera ^23,36y CWD ^{38,39,40,41, 42}. Estudios usando procesan líquido cefalorraquídeo, sangre, saliva y orina como semillas en RT-QuIC todos lograron detectar PrP^{Sc 38,39,40,41, 42}. fomentar la capacidad de detección en muestras de plasma de la sangre que puede contener inhibidores de la formación de amiloide, Orrú et al. (2011) desarrolló una estrategia para eliminar potenciales inhibidores de la formación amiloide peinando PrP^Sc paso de inmunoprecipitación (IP) y RT-QuIC, llamado “mejorado QuIC” ensayo (eQuIC). Además, un paso de recambio de sustrato se empleó después de ~ 24 h de tiempo de reacción para mejorar la sensibilidad. En última instancia, como solo 1 ag de PrP^Sc era perceptible por el eQuIC ³⁰.

Con el fin de purificar extractos de las heces y eliminar inhibidores de posible análisis en heces, muestras de heces recogidas en las fases preclínicas y clínicas de alce sobre infección oral experimental se homogeneizaron en tampón que contiene detergentes e inhibidores de la proteasa. Los extractos de las heces más fueron sometidos a diferentes metodologías para PrP^Sc se concentran en las muestras utilizando la precipitación de la proteína en el ácido (NaPTA) precipitación de sodio fosfotúngstico. El método de precipitación de NaPTA, primero descrito por Safar et al. ⁴³, se usa para PrP^Sc se concentran en las muestras de prueba. La incubación de NaPTA con la muestra de resultados en la precipitación preferencial de PrP^Sc en lugar de PrP^C. Sin embargo, el mecanismo molecular es todavía incierto. Este paso también ayudó a contener y prevenir la conversión espontánea de formará, que se observa en algunos casos. Finalmente, los extractos de las heces se analizaron optimizado RT-QuIC usando ratón formará (aa 23-231) como sustrato y como recambio de sustrato en el protocolo para mejorar la sensibilidad de detección.

Los resultados aquí demuestran que este método mejorado puede detectar muy bajas concentraciones de priones CWD y aumenta la sensibilidad de detección y especificidad en muestras fecales en comparación con un protocolo sin reemplazo de precipitación y el substrato de NaPTA. Potencialmente, este método puede ser aplicado a otros tejidos y fluidos corporales y puede ser de gran utilidad para la vigilancia de CWD en cérvidos silvestres y en cautiverio.