我们描述了一种实验程序, 测量双光窗口以上的双光窗口双侧原生体感骨 (s1) 在 thy1-gcmp6 转基因小鼠使用2光子 (2p) 显微镜在体内 .
哺乳动物的大脑在矢状面上表现出明显的对称性。然而, 对成年哺乳动物大脑对称区域的神经动力学的详细描述仍然难以捉摸。在本研究中, 我们描述了一个实验程序, 测量钙动力学通过双光窗口以上的双侧原生体感皮层 (s1) 在thy1-gcmp6 的转基因小鼠使用2光子 (2p) 显微镜。这种方法可以在同一实验中长时间地记录和定量双侧小鼠大脑区域的神经活动. 此方法的关键方面, 可以在一个小时内完成, 包括微创手术程序, 以创建双光窗, 和2p 成像的使用。虽然我们只在 s1 区域演示了这一技术, 但该方法可应用于活体大脑的其他区域, 从而促进大脑神经网络结构和功能复杂性的阐明。
钙及其调节是调节多种生理过程所必需的。监测钙动力学有助于了解正常的大脑功能以及大脑疾病的病理条件1,2,3, 4,5,6 ,7,8。成像 gcmp6 荧光是一个强大的工具, 用于量化尖峰数量, 时间和频率, 以及突触输入水平的体外和体内 9, 10,11。
哺乳动物的大脑在矢状面上表现出明显的对称性。尽管最近的神经研究揭示了创伤性脑或脊髓损伤6、7引发的皮质重塑和神经元活动, 但对称对应区域的完整组织所发挥的作用在复苏仍然是模糊的。
在本研究中, 我们描述了用于体内成像的双侧对称光窗口的实验过程。利用这些光学窗口, 我们描述了使用2p 显微镜测量 gcmp6 转基因小鼠的原代体感皮质 (s1) 中的钙动力学。在结果部分, 我们还显示了在体内树突形态在不同的时间点在 s1 区域的 egfp 转基因小鼠使用2p 成像。双侧 s1 区域网络动力学的观察方法只是一个初步的例子, 说明双开放颅窗将如何帮助神经科学家在正常情况下探索成年哺乳动物大脑中的局部和对称信息处理条件或在体内不同的疾病模型。
双光子成像可在大脑表面以下约800微米的情况下, 以合理的分辨率同时测量许多细胞的活动。我们将2p 和双光学窗口技术与基因编码的 gcmp6 结合起来, 观察位于皮亚下方 v 型神经元 somata 种群中的钙动力学。该方法在头骨两侧都有一个开放的光学窗口, 可以记录对称哺乳动物大脑区域的神经活动, 以便在体内进行长时间稳定的钙成像。该方法的主要方面包括微创手术的性能, 以创建双开放的头骨光学窗口和2p 成像的神经元活动在对称 s1 区域。
研究双侧 s1 区域的网络活动是如何利用双颅窗探测成人大脑在体内的局部和对称信息处理的一个例子。该方法也可用于研究神经元活性 (例如使用thy1-gmcmp6小鼠) 和皮质可塑性 b6。cg-tg (thy1-yfp) hjrs j 从完整的组织中恢复在分离后, 由于单侧中枢神经系统损伤。该方法还可用于检查皮质活性响应周边刺激策略, 如光生, 电或化学刺激。虽然我们只在 s1 区域演示了这一技术, 但这种方法可用于调查活脑中其他对称区域的活动, 如初级运动皮层 (m1) 的 v 层神经元。脑区域重组观察可为自适应运动行为提供神经底物, 对损伤后功能恢复起着至关重要的作用。它还允许长期测量在头固定小鼠的行为过程中基因鉴定细胞的对称活性。
从技术上讲, 研究人员应注意双颅窗的质量和一致性。薄颅骨窗技术12是强烈推荐初学者练习。脊柱是钙的隔间, 因为它们的形态和局部流入和挤压机制。在这项研究中, 我们使用了 b6。以 cg-tg (thy1-yfp) HJrs/J j 小鼠为例, 在体内演示树突状脊柱动力学 (图 4)。开放的头骨玻璃窗可能会导致高脊柱周转和手术后的反应胶质反应 12 。相反, 与薄头骨窗口技术, 刺和树突可以很好地保存。
光学窗口的尺寸和厚度的选择将取决于所需的视野、头骨曲率、头骨厚度和成像类型13。光学覆盖玻璃对硬脑膜的压力不足可能会导致硬脑膜变厚、颅骨再生和大脑运动增加。相反, 光学覆盖玻璃的过度压力可能会阻碍皮质血液流动。
对于光学窗口组装, 胶和固化额外的层覆盖玻璃一次与光学胶粘剂和长波长的紫外线。为了帮助加强粘接, 在孵化器中加热制造的窗口 (50°c, 12小时)。将光学窗覆盖玻璃储存在70% 的乙醇中, 并在手术前用无菌盐水冲洗。在使用之前, 需要检查光学窗口是否有缺陷 (如光学胶粘剂量不正确或对齐不准确), 以避免故障。如果光学胶粘剂太薄, 空气空间可能会被折痕, 这可能会导致光学畸变或在植入时覆盖玻璃脱离。相反, 过多的光学胶粘剂会导致溢出通过颅窗的边缘。
总之, 我们在这里描述了一个实验程序, 测量钙动力学或树突状形态通过颅窗从2个对称的原生体感觉皮质区域在 thy1-gcmp6 和 thy1-yfp 转基因小鼠, 分别使用2p 显微镜。该技术可以极大地促进神经网络复杂的结构和功能关系的剖析。
The authors have nothing to disclose.
我们非常感谢美国纽约大学医学院生理学和神经科学系 skirball 研究所和医学编辑帕蒂·雷利 (印第安纳州神经外科系) 提供的优秀技术指导大学医学院), 用于编辑手稿。我们感谢陈金辉博士 (美国印第安纳大学医学院斯塔克神经科学研究所) 提供 b6。cg-tg (thy1-yfp) hjrs j 小鼠。这项工作得到了中国济南军区总医院院长基金会的部分支持, pla 2016zd03 (xjl), 和 nih ns05922, ns073636, dod cdmrp w81xwh-12-1-0562, 美国退伍军人部的优异评论奖 i01 bx002356事务, craig h neilsen 基金会 296749, 印第安纳脊髓和脑损伤研究基金会, mari hulman george 捐赠基金 (xmx)。
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | – | – | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |