Vi beskriver användningen av laser fånga lokalt att erhålla prover av olika cellpopulationer från olika hjärnregioner för gen- och mikroRNA analys. Denna teknik tillåter studier av differentiella effekter av traumatisk hjärnskada i specifika regioner i råtthjärna.
Möjligheten att isolera delar av hjärnan av intresse kan hindras i vävnad disassociation tekniker som inte bevarar deras rumsliga fördelning. Sådana tekniker skeva också potentiellt gen uttryck analys eftersom själva processen kan förändra uttrycksmönster i enskilda celler. Här beskriver vi en laser fånga lokalt (LCM) metod för att selektivt samla delar av hjärnan påverkas av traumatisk hjärnskada (TBI) med hjälp av en modifierad Nissl (tolyloxi violett) färgning protokoll och vägledningen av en rat brain atlas. LCM ger tillgång till hjärnan i sina ursprungliga positioner och förmågan att använda anatomiska landmärken för identifiering av varje specifik region. I detta syfte har LCM använts tidigare att undersöka hjärnan regionen specifika genuttryck i TBI. Detta protokoll tillåter granskning av TBI-inducerade förändringar i genen och mikroRNA uttryck i olika hjärnområden inom samma djur. Principerna för detta protokoll kan ändras och tillämpas på ett brett utbud av studier som undersöker genomisk uttryck i andra sjukdom eller djurmodeller.
Däggdjur hjärnan är anmärkningsvärt komplex och heterogen med hundratals till tusentals cell typer1. Faktiskt, studier på människa har visat att i regioner såsom främre hjärnbarken, strukturella och funktionella skillnader i vit och grå materia återspeglas i distinkt och divergerande transkriptionell profiler2. Hjärnan heterogenitet har varit ett stort hinder att tolka gen uttryck data och i fältet av hjärnskada. Denna tvetydighet i prekliniska studier har därefter lett till hundratals misslyckade kliniska prövningar av behandlingar för hjärnan skada3.
Vi använder laser fånga lokalt (LCM) metoder för att studera traumatisk hjärnskada (TBI)-inducerade genen dysreglering råtta hjärnan4, med fokus på hippocampus, en hjärnregionen som är nödvändig för inlärning och minne5. Förmågan att laser fånga och analysera genuttryck i både dö och överleva nervceller ger oss en större förståelse för rollen som stochasticity i genuttryck för att kora (neuronal överlevnad) efter TBI6. LCM tekniker har också visat sig användbara för att utforska effekterna av TBI på Hippocampus nervceller när man jämför unga och åldrande möss7 eller råttor8.
I senare studier har undersökt vi andra regioner i råtthjärna negativt av TBI, med fokus på områden hos råtta och människa TBI-patienter som är associerade med verkställande funktionen (dvs frontala cortex9) och TBI samsjuklighet; dessa sjukdomstillstånd inkluderar depression (dvs nucleus accumbens10) och dygnsrytmen störningar (suprachiasmatiska kärnan11). I tidigare studier, Huusko och Pitkanen12 och Drexel o.a. 13 brukade LCM undersöka genuttryck i thalamus och hypothalamus. Vår studie bygger på dessa tidigare observationer och inkluderar fyra andra regioner i hjärnan. För att studera de region-specifika molekylära förändringar inducerade efter TBI, var det nödvändigt att få kompetens att identifiera och få celltyper i dessa regioner som använder ett LCM-system. UV-skära och infraröd (IR) lasrar möjliggör exakt lokalt av önskad hjärnregioner. Här beskriver vi hur vi använder LCM systemet, vägledda av stereotaxic koordinater i rat brain atlas14, för att identifiera och laser fånga fyra råtta regioner i hjärnan som påverkas differentially av metoden experimentella vätska-slagverk hjärnan skada 4.
Molekylära studier av däggdjur hjärnan, har LCM blivit en viktig teknik. Denna artikel visar att använda en kombination av IR och UV-skära lasrar i LCM systemet kan fånga genomiska förändringar i någon region av hjärnan som däggdjur. Dessa regioner omfattar de identifierbara med konventionella LCM-kompatibel fläckar, såsom tolyloxi violett eller hematoxylin och eosin. Hastigheten på laser-fånga processen och förmåga att utföra LCM på tjockare 30 µm sektioner på pennan membran bilder tillåter inte bara erhålla tillräckliga kvantiteter av cellprover, men också att isolera RNA från LCM prover av lämplig kvalitet för alla typer av nedströms Genomanalys; dessa analyser inkluderar microarrays16, PCR matriser17och kvantitativ realtids PCR-18.
Våra data ge en motivering för studier som använder LCM vävnad. Finner vi att miR-15b är uppreglerad i hippocampus och cortex (figur 4) men nedreglerade i kärnan accumbens och kan vara biologiskt relevanta för förståelsen av differentiella effekter av TBI i hjärnan. En tidigare studie föreslog att ökningar av kortikala neuronala sårbarhet för skada resultera från överuttryck av flera MicroRNA som negativt reglerar Pro överlevnad gener, såsom Bcl-219. Målet scan analys visar Bcl-2 regleras också av miR-15b; alltså våra data tyder på en mekanistisk förklaring till varför vissa regioner av hjärnan (dvs., FCx) selektivt kan utsättas för TBI. Det är viktigt att komma ihåg de flesta gener regleras av flera MicroRNA och korrelera förändringar i någon en miRNA till en specifik gen är svårt. Dessa data indikerar dessutom att vissa förändringar i genen och mikroRNA uttryck kan användas som biomarkörer för region-specifika hjärnskador. Ja, vi använder dessa data i studier av hur nya nervskyddande läkemedelssubstanser med antidepressiva egenskaper differentially kan påverka genen och mikroRNA uttryck i regioner av hjärnan kopplade till neuropsykiatriska funktionsnedsättningar. En begränsning av vår studie är att under flera steg i bild bearbetningsprocesser för LCM, RNA integritet kan bli nedsatt. Det här protokollet beskriver nödvändiga åtgärder för att minska risken för RNA nedbrytning. En annan begränsning är den relativt lilla urvalet används för statistisk beräkning. I framtida bör studier, ökande stickprovsstorlek minska effekterna av genen och miRNA uttryck variationer bland enskilda djur.
Nyttan av LCM realiseras i translationell genomisk studier med hjälp av djurmodeller av mänskliga sjukdomar och sjuk vävnad20,21,22,23. Utan förmågan att fånga specifika cellpopulationer, vore transkriptionell profiler för olika hjärnregioner en omöjlig och undecipherable mix av många celltyper. Med hjälp av LCM metoder i hjärnan skada studier har lett till nuvarande ansträngningar att avgränsa hjärnan regionen specifika biomarkörer och förstå hur de korrelerar med cirkulerande biomarkörer för TBI.
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja erkänna Elizabeth Sumner för hennes hjälp med att redigera Detta manuskript. Finansiering för projektet lämnades delvis av The Moody Project för translationell traumatisk skada hjärnforskning och RO1NS052532 till HLH.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |