JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Стереотаксическая Атлас руководствуясь лазерная захватить Microdissection регионов мозга, пострадавших от травмы

Published: September 11, 2017
doi:
10.3791/56134
, , ,
1Department of Anesthesiology,University of Texas Medical Branch

Summary

Мы описывают использование лазерных захвата microdissection для получения образцов различных клеточных популяций из мозга различных регионов для анализа генов и микроРНК. Эта техника позволяет исследования дифференциальных последствий черепно-мозговой травмы в конкретных регионах мозга крысы.

Abstract

Способность изолировать конкретных мозга регионы интереса можно препятствует в ткани диссоциации методов, которые не сохраняют их пространственного распределения. Такие методы также потенциально наклон анализ выражения гена, потому что сам процесс может изменить шаблоны выражений в отдельных клетках. Здесь мы описываем microdissection (LCM) методом лазерной захвата выборочно собрать конкретные мозга регионов, пострадавших от черепно-мозговой травмы (ЧМТ) с помощью модифицированных Ниссль (количество кресил фиолетовый), окрашивание протокол и руководством Атлас мозга крысы. LCM обеспечивает доступ к области мозга в их собственные позиции и возможность использования анатомические ориентиры для идентификации каждого конкретного региона. С этой целью LCM ранее использовались для изучения мозга регионе конкретных генов выражение в TBI. Этот протокол позволяет изучение TBI-индуцированные изменения экспрессии генов и микроРНК в районах собственный мозг в то же самое животное. Принципы настоящего Протокола может быть поправки и применен к широкий спектр исследований, Изучение геномной выражения в других заболеваний и/или животных моделей.

Introduction

У млекопитающих мозг удивительно сложные и неоднородных с сотнями тысяч клеток типа1. Действительно человеческие исследования показали, что в таких регионах, как лобной коры, структурные и функциональные различия в белых и серых вопроса, отражены в отдельных и различных транскрипционный анализ профиля2. Мозг гетерогенности был основным препятствием для интерпретации данных выражение гена и в области черепно-мозговой травмы. Впоследствии эта двусмысленность в доклинических исследованиях привело к сотни неудачных клинических испытаний лечения травмы мозга3.

Мы используем лазерные захвата microdissection (LCM) методы для изучения черепно-мозговой травмы (ЧМТ)-индуцированной регуляции генов в крыса мозга4, сосредоточив внимание на гиппокампе, области мозга, которая необходима для обучения и памяти5. Способность лазерные захвата и анализа экспрессии генов в умирающих и выжившие нейронов дает нам более глубокое понимание роли stochasticity в экспрессии генов в определении результата (выживаемость нейронов) после ЧМТ6. LCM методы также оказались полезными для изучения последствий TBI на Нейроны гиппокампа, при сравнении молодых и старение мышей7 или крысы8.

В недавних исследованиях мы рассмотрели другие регионы мозга крысы, негативно сказалось, TBI, с упором на районы, крыс и человека TBI пациентов, которые связаны с исполнительной функции (т.е. лобной коры9) и TBI сопутствующих заболеваний; Эти сопутствующих заболеваний включают в себя депрессию (т.е. nucleus accumbens10) и циркадного ритма (Супрахиазмальное ядро11). В предыдущих исследованиях, Huusko и Питканена12 и Drexel et al. 13 использовали LCM для изучения экспрессии генов в таламуса и гипоталамуса. Наше исследование опирается на эти предыдущие замечания и включает в себя четыре других регионов мозга. Для изучения конкретного региона молекулярные изменения, вызванные после ЧМТ, было необходимо получить опыт в поиске и получении типы клеток в этих регионах, используя систему LCM. УФ резки и инфракрасный (ИК) лазеры позволяют точное microdissection желаемого мозг регионов. Здесь мы описываем, как мы используем эту систему LCM, руководствуясь стереотаксического координаты в крыса мозга Атлас14, для выявления и лазерные захвата четыре крысы регионах мозга различной степени подверженных методом экспериментальная жидкость перкуссия мозга травмы 4.

Protocol

Примечание: все эксперименты на животных по указанию национальных институтов здравоохранения руководство для ухода и использования утверждаются институциональный уход животных и использование комитета университета Техаса Медицинское отделение, Галвестон, штат Техас Лабораторных животных (8-е издание, Национальный исследовательский совет). 1. ткани коллекции, регионе идентификация и Sectioning Тема взрослого, миастения, крысы Sprague-Dawley, примерно шесть недель и 250-300 г, экспериментальный жидкости перкуссия травмы, как описано в Shimamura и др. 4. двадцать четыре часа после экспериментальной TBI, гуманно усыпить животных, помещая их в камере с 4% до глубоко под наркозом изофлюрановая концентрации. Обеспечения смерти путем обезглавливания, акцизный мозги и немедленно заморозить в порошок сухого льда. Хранить замороженные мозги в морозильной камере-80 ° C до резании. Перед любой LCM процедуру, которая включает в себя транскрипционный анализ анализ, очистите все поверхности с РНКазы ликвидации моющее средство для смягчения риска загрязнения и деградации РНК. Примечание: Эта уборка включает в себя площадь, используемая для окрашивания, криостат, где секционного ткани, и район вокруг устройства LCM. Получить ткани мозга от хранения и место в криостат, охлаждается до -20 ° C. разрешить мозг, чтобы сбалансировать до температуры камеры криостата на ~ 10 мин Место вентральной стороне мозга вверх на листе марлей на вершине стадии криостата. С чистой, RNase Бесплатные лезвие бритвы, отрезали задняя часть просто ростральной мозжечка (может быть сохранены или удалены) и часть просто впереди зрительных нервов (оч). Место небольшое количество средних температур (OCT) оптимального раскроя в два отдельных cryomolds. Место мозга (содержащий фронтальной ассоциативной коры (FrA) и nucleus accumbens ядра (AcbC)) в cryomolds передней стороной вниз. Добавьте достаточно среднего OCT для покрытия ткани. Повторить этот шаг с мозговой ткани, содержащие гиппокампа (Hp) и Супрахиазмальное ядро (SCN). Позволяют средство OCT заморозить полностью на ~ 20 мин в криостата. Ткани и OCT среднего полностью заморожены, выдавить небольшое количество октября на монтаж голову и нажмите замороженных cryomolds, содержащий ткань на голову монтажа. Разрешить OCT заморозить полностью так, что плесень, содержащий ткань надежно подключен к голове. Безопасное глава вложений на секущей гору и затяните винт. Отрегулируйте угол резки по отношению к криостат лезвие с рычаги регулировки для обеспечения секции вырезаются равномерно. Значение секции толщиной 30 мкм. При резании ткани блок, содержащий ОЛР и AcbC, сначала начать резании до коры головного мозга является очевидным и затем начать сбор. Ссылающиеся 12 Атлас мозга крысы, секции и собирать мозга, разделы, аккуратно поставив комнатной температуре полиэтилен napthalate (PEN) мембраны слайды на вершине секционного ткани для ОЛР до вторичного моторной коры (м2 ) достигается в Bregma 5.16 мм. Визуально обеспечить присоединение к слайду, проверяя, если ткани и OCT полностью растаял на слайд. Хранить все слайды с разделов ткани в криостата до окрашивания. Продолжать резании до передней спайки (aca) становится видимым и объединяет в один полный спайки под теперь очевидным боковых желудочков (LV) на Bregma 1,80 мм. Собирать секций до рН, как представляется, соединиться с aca на Bregma 0,84 mm. После завершения секционирование для ОЛР и AcbC удалить блок монтируется ткани и замените блок, содержащий HP и SCN. Раздел до тех пор, пока och выравнивается в Bregma -0.48 мм, когда становится очевидным, третий желудочек (3В). Сбор секций для СКС от этой точки до Bregma мм -0.72, когда начинается supraoptic перекрест (sox). Примечание: Это может быть необходимо собрать больше разделов ткани во всем och как СКС легко передается. Для HP коллекции, разделе до тех пор, пока рога гранул ячейки слое зубчатой извилины (GrDG) заметно проявляются в Bregma -3.00 мм. Сбор разделы пока гиппокампа подполей CA сплавлены в корональных секциях в Bregma-4.78 мм. Эта деталь позволяет полное собрание гиппокампа на узле краниотомии и травмы. Примечание: Как показано в предыдущих публикаций из этой лаборатории, наиболее пострадавшей клетки будет очевидным в этом диапазоне и она подходит для анализа выражения гена или микроРНК. 2. Пятнать протокол предварительного окрашивания, мыть все посуда и окрашивания области в химической Зонта с моющим средством устранения РНКазы. Этот препарат снижает риск РНК деградации вследствие загрязнения. Подготовить все реагенты окрашивание и решения в нуклеиназы свободной воды. Принять стойку слайдов, хранящихся в криостат и место в зонта. Разрешить слайды, чтобы согреть за 30 с. место их в пятнать решения (подготовленных с бесплатной водой нуклеиназы) следующим образом: 75% EtOH за 1 мин, нуклеиназы свободной воды за 1 мин, 1% количество кресил фиолетовый за 1 мин, нуклеиназы бесплатная вода для 30 s, нуклеиназы бесплатная вода для 30 s , 95% EtOH за 30 сек, 100% EtOH 30 s, ксилол 3 мин и ксилол на 3 мин Позволяют стойки высохнуть не более 10 мин при комнатной температуре в зонта. Кроме того место стойки в бесплатно РНКазы вакуумного эксикатора для быстрого высыхания. После того, как сушеные, немедленно приступить к LCM. 3. Стереотаксическая Атлас руководствуясь лазерная захватить Microdissection с системой LCM до начала любой процедуры LCM для анализа РНК, протрите области коллекции и район вокруг устройства с ликвидации РНКазы моющих средств и 100% EtOH. Флип выключатель питания на ИК лазерной генерирующих до поворота на микроскопе базы и позволить системе инициализации перед запуском программы с рабочего стола. Примечание: Если не завершена в таком порядке, программное обеспечение не распознает микроскопом. Программное обеспечение загрузки и запустить через свои шаги инициализации, нажмите " нынешний этап " кнопку в программном обеспечении " установки панели. " Модульная этапе будет двигаться в позицию, где LCM макрос шапки и слайды можно загружать и разгружать. Место пера мембраны слайды в держатели (до трех, в то время) с матовыми краем вправо. Примечание: Если установлен в держателе в неправильно ориентации, программное обеспечение может не сможет должным образом признать желаемого ИК и УФ лесосеки. Нажмите " Mem " флажок в " крышку и обработка области слайда " рядом с соответствующими слайд (то есть, A, B или C). Этот шаг обозначает, если слайд слайд стекла мембраны. Затем нажмите на нужный слайд, чтобы сначала захватили. Выберите , чтобы сделать камеру взять мозаичного изображения на ткань местоположение и ориентацию для размещения Кап, " изображение " на панели инструментов и выберите " получить обзор. " Примечание: Если пользователь знаком с ткани собираются, этот шаг можно опустить с помощью ручной прокрутки мяч в положение " региона центр " для сбора. Поместите курсор над районом на мозаичного изображения (или относительное расположение без мозаичного изображения), щелкните правой кнопкой мыши и выберите " место Cap в регионе центра. " программное обеспечение будет автоматически поместить шапку над выбранной позиции. Выберите местоположение. Примечание: Обеспечить ИК лазер должным образом выравнивается и будет забрать только областей, где проложены пятна от программного обеспечения он должен находиться перед продолжением. Перемещение в район в рамках ПСП, где присутствует не ткани. Нажмите кнопку " я " в " Microdissect панель инструментов " и выберите " ИК найдите " вкладка. Из панели, огонь ИК тест выстрелил оценить где стрельбы ИК лазер и размер пятна. С курсором, щелкните правой кнопкой мыши в середине IR пятно и выберите " расположен ИК Spot. " Примечание: Размер и интенсивность ИК луча могут быть изменены вручную изменив " мощности, диаметр или продолжительность " под каждой обозначение размера пятна или перемещая скользящей шкалы в нижней части диалогового окна. Несколько пробных снимков может потребоваться быть уволены для обеспечения надлежащего размера пятна. ИК-лазер должен находиться заново каждый раз, когда включаются положения Кап изменений или слайды. Для УФ резки, найдите УФ лазер, выбрав " найдите УФ " вкладки в диалоговом окне. Примечание: Потому что лазер УФ и ИК лазер двигаться в унисон, нет необходимости постоянно повторно найти УФ лазер каждый раз, когда меняется позиция. Выберите " Рисунок от руки " в параметр " выберите панель инструментов ". Используя сенсорный экран стилусом, нарисуйте вокруг периметра области интереса а убедившись, чтобы не потерять контакт между сенсорного экрана и стилуса головы. Убедитесь, что соединять в начале и конечные. Примечание: ИК пятна будут изложены автоматически через программное обеспечение, но пользователь может выбрать сложить дополнительные места для обеспечения ткани привязана к крышке после выполнения резки УФ. Коллекции для ОЛР, выполняют брутто лазерной захвата кортикального слоя ткани до появления коры м2 в Bregma 5.16 мм. Примечание: Эта деталь может быть изменен таким образом, что собираются только конкретных частей ОЛР или типы конкретных клеток. Коллекция для AcbC, лазерный захвата области закрыть в близости к aca. Ядро и оболочки AcbC выполняют различные функции и физиологически уникальны. Таким образом важно следовать мозга Атлас как можно ближе. Рекомендуется собирать от не дальше, мимо bregma 0,84 мм, как двух субрегионах становятся слишком тесно связаны друг с другом. Для Hp коллекции, лазерная захватить CA 1, 2 и 3 гиппокампа подполей начиная Bregma 3.00 мм и используя полностью сформированные GrDG как физической ориентир для морфологической идентификации. Примечание: Для целей настоящего исследования, не собирают мимо Bregma-4.78 мм, который можно визуально демаркирована как точка когда Hp подполей сплавлены и вентрально точки. Этот район был выбран как наиболее ранения нейроны могут быть обнаружены непосредственно под сайт травмы 6. Для коллекции SCN, сначала визуально определить плотно упакованных ядер, которые сидят спинной och и затем собирают. После коллекцию областей (перечислены выше), переместите LCM макрос шапки для " КК позиции " и проверять соблюдение полного ткани обеспечивая визуально УФ вырезать ткань прилагается к мембране. Быстро поместить шапку ontoan бесплатно РНКазы 0,5 мл тонкой стеной реакции трубка, содержащая 100 мкл буфера lysis клетки. Образцы vortex кратко, чтобы обеспечить полный лизис и хранить при температуре-80 ° C. На данный момент, может быть приостановлена LCM и образцы хранятся до тех пор, пока используется для вниз по течению геномный анализ 6.

Representative Results

Схема представлена на рисунке 1 иллюстрирует общий рабочий LCM Атлас руководствоваться конкретными мозга и потенциальных течению анализ приложений. Это исследование сосредоточено на четырех областях мозга, отношение к TBI патофизиологии и развития сопутствующих заболеваний: ОЛР, AcbC, СКС и Hp. Ограничение в LCM конкретных мозга является, что анатомических местах часто скрывается отсутствие определенных границ, как можно увидеть в рисунке 2 (A, D, G, J). Использование мозга Атлас секционирование и лазерные захвата конкретных регионов уменьшает вероятность загрязнения образца с регионов мозга, помимо цели. Когда осторожность следовать ткани достопримечательности, как при резании, так и после окрашивания Ниссль, LCM технология может обеспечить весьма последовательной средством приобретения отдельных популяций клеток, ядер или регионам15. Долгосрочные цели этих исследований являются для идентификации генов и микроРНК, который потенциально может служить в качестве суррогата, неинвазивная биомаркеров конкретных ушиба мозга регионе. Первый шаг в этот трубопровод биомаркер развития является характеристика тканей специфичных transcriptional изменений после экспериментальной TBI. Эти данные затем могут быть связаны с травмы индуцированные изменения в распространении biofluids. Представленные процедуры были оптимизированы для смягчения риска деградации РНК для того, чтобы позволить РНК анализа через обратная транскрипция всего LCM РНК до количественной ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР). Общая РНК (в том числе мелких и крупных видов РНК) был изолирован с помощью метода изоляции на основе столбца на ткани, который был захвачен лазера от индивидуальных мозга. Для оценки целостности РНК, качества и количества после процедуры изоляции, РНК образцы были кратко денатурированный при 70 ° C и запустить на РНК анализатора. Качественные измерения включают анализ пик амплитуд 18s и 28s рРНК полос ()Рисунок 3), который может быть представитель общей деградации и с помощью «РНК целостности номер» (Рин). Если с помощью тщательного бесплатно РНКазы техники, РНК изолированы от LCM образцов обычно результаты в промывки, которые варьируются от 6-8. Нижняя Рин может означать низкое качество РНК и потенциально может уменьшить точность анализа выражения гена и микроРНК. И наоборот выше RIN можно улучшить уверенность в достоверности результатов, созданные из РНК анализа. RT-ПЦР была выполнена с использованием наборов праймер/зонд для отдельных генов и микроРНК (рис. 4). Примерно 1 нг всего РНК была обратной транскрипции в cDNA и предварительно усиленный перед ПЦР была выполнена согласно протоколу от производителя. Травмы связанных генов, оценены в этом исследовании были X связанный BCL2, регулятор апоптоза (Bax), B-клеточной лимфомы/CLL 2 (Bcl-2), Caspase-3, пептидаза хвоща Apoptosis-Related (Casp3) , Мозг производные нейротрофических факторов (Bdnf) и лагерь реагировать элемент привязки протеин 1 (Creb). Мир 15b был выбран потому, что было показано, быть изменены после экспериментальной TBI в умирающего индивидуальных нейронов. Он также экспериментально проверен и bioinformatically предсказал цели гена с функциями про выживание (неопубликованные данные). Нормализованное фолд изменения соотношения были рассчитаны методом ΔΔCt, сравнение уровней выражение гена и микроРНК в TBI животных и наивно контроль, с нормализацией эндогенного гена (Gapdh) или малые РНК (U6), соответственно. Фолд изменения выше 1 указывает общую upregulation в этом ген или микроРНК, и наоборот, раз меньше, чем 1 указывает Даунрегуляция изменить. Статистический анализ показал значительные изменения в экспрессии генов между ЧМТ и наивно управления (p ≤ 0,05), зависят от области мозга. Никаких существенных изменений в выражении мир 15b были обнаружены между управления ЧМТ и наивно, но там были тенденции к выше и ниже выражение в мозг региона зависит от моды. Эти данные указывают на то, что дальнейшая оптимизация необходимо оценить изменения в выражении микроРНК. Это также возможно, размер выборки был слишком мал, чтобы получить статистической значимости, отчасти из-за присущих изменчивости в выражении. Будущие исследования будет включать в себя Шам эксплуатируемых животных, чтобы обеспечить этот ген и микроРНК выражение изменения связаны с ЧМТ и не из-за хирургической подготовки. Рисунок 1. Рабочий процесс Атлас руководствуясь LCM течению геномного анализа. (A-F) Процедуры из животных подготовки к течению ПЦР анализ: (A) взрослых, мужской Sprague-Dawley крыс (~ 6 недель возраста и весом 300 г) под наркозом, подвергаются жидкости перкуссия TBI и гуманно euthanized 24 ч после травмы. (B) последовательных секций (30 мкм) свежие замороженных мозгов основаны на координаты регионов конкретных мозга (ОЛР, AcbC, Hp, SCN) от Paxinos и Уотсон Атлас мозга крысы. (C) секции фиксированной, окрашенных Ниссль (1% количество кресил фиолетовый), обезвоженная и воздушная сушка. (D). LCM осуществляется на определенных областях мозга с LCM системой. (E) LCM макрос шапки переносится на свободных РНКазы 0,5 мл трубки с 100 мкл буфера lysis клетки и хранятся при температуре-80 ° до РНК изоляции ниже по течению геномного анализа. РНК могут затем быть обратной транскрипции гена или микроРНК RT-ПЦР анализа для изучения дифференциального проявление молекулярных ориентация после ЧМТ и/или между регионами мозга (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. LCM TBI пострадавших регионах мозга. Представитель образы разделов ткани собранных со стороны ипсилатеральные травмы сайта с ИК и УФ лазерной функций в системе LCM (A-я). Ткань была секционного на криостата (30 мкм) и собранные на перо мембраны слайды. Разделы затем фиксировали, окрашенных Ниссль с количество кресил фиолетовый (1%) и обезвоженной для выявления конкретных мозга регионов на основе анатомических ориентиров, ссылка в Paxinos и Уотсон Атлас мозга крысы. (A-C) Площадь фронтальной ассоциативной коры (FrA) (D-F) компоненты СА1, CA2 и CA3 пирамидных слоев гиппокампа (Hp) расположен рядом с полностью сформированные рога слое гранул зубчатой извилины (GrDG). (G-I) Площадь nucleus accumbens coRe (AcbC) проксимальный и Ростральные передней спайки (aca). (J-K) Супрахиазмальное ядро (SCN) ростральной supraoptic нервов (оч). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. Представитель проверок качества РНК. Представитель electropherograms и изображений связанных гель РНК, производный от LCM собраны ткани (A-D). Electropherograms и связанных гель изображения показывают нетронутыми РНК, основанный на появление 18s и 28s рРНК пиков и гель полос. Эта РНК подходит для всех нисходящие приложения, в том числе геномная и протеомных анализов. (A) фронтальной ассоциативной коры (FrA) РНК. РИН 6.1. (B) гиппокампа (Hp) РНК. РИН 4.4. (C) прилежащем основных РНК (AcbC). РИН 7.3. (D) Супрахиазмальное ядро (SCN) РНК. РИН 7,6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4. Вниз по течению анализ мозга конкретного региона гена и микроРНК выражение через RT-ПЦР. Индивидуальные RT-ПЦР для генов интерес (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) и микроРНК интерес (мир 15b) была выполнена на лазерной захватили регионах мозга после ЧМТ (Hp и AcbC n = 5, ОЛР n = 4) и по сравнению с ранен наивно животных (n = 4). Был проведен анализ генов, связанных с TBI патогенеза для Hp, AcbC, FCx. данные представлены в виде нормализованного раз изменения соотношения по сравнению с наивными управления мозга регионов (неспаренный t-тест с Уэлча коррекции ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Дифференциальный выражение мир 15b в различных мозга представлена как нормализованное раз изменения по сравнению с наивными управления (± SEM) (B). Данные из SCN (n = 2) не включены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Для молекулярных исследований млекопитающих мозга LCM стал важным технику. Эта статья демонстрирует, что использование комбинации ИК и УФ лазеров резки в системе LCM может захватить геномных изменений в любом регионе млекопитающих мозга. Эти регионы включают идентифицируемых с обычными LCM-совместимых пятна, такие как количество кресил фиолетовый или гематоксилином и эозином. Скорость процесса лазер захвата и способности выполнять LCM толще 30 мкм разделов на слайдах мембраны пера позволяет не только получить достаточного количества образцов клеток, но и изолировать РНК из образцов LCM соответствующего качества для всех типов вниз по течению Геномный анализ; Эти анализы включают microarrays16, ПЦР массивы17и количественных реальном масштабе времени PCR18.

Наши данные предоставлять обоснование для исследований, которые используют LCM ткани. Мы находим, что мир 15b upregulated в гиппокампе и коры (рис. 4), но downregulated в прилежащем и может быть биологически отношение к пониманию дифференциального воздействия TBI в головном мозге. Предыдущее исследование показало, что увеличение корковых нейронов уязвимость травмы в результате гиперэкспрессия несколько адаптивной, которые отрицательно регулирования про выживания генов, например, Bcl-219. Целевые проверки анализ показывает Bcl-2 регулируется также мир 15b; Таким образом, наши данные позволяют предположить механистическое объяснение почему конкретных областей мозга (т.е., FCx) могут быть выборочно подвержены TBI. Важно помнить, большинство генов, регулируются несколькими адаптивной и корреляция изменения в любой одной miRNA к гену конкретных целевых трудно. Кроме того эти данные показывают, что определенные изменения экспрессии генов и микроРНК может использоваться в качестве биомаркеров повреждения мозга конкретного региона. Действительно, мы в настоящее время используют эти данные в исследованиях как новые нейропротекторной наркотиков соединений с антидепрессант свойства можно дифференциально влияет на выражение гена и микроРНК в областях мозга, связанных с нервно-психиатрическими расстройствами. Одно ограничение нашего исследования является, что на нескольких этапах процессов подготовки слайдов для LCM, может стать угрозой целостности РНК. Этот протокол описывает необходимые шаги для смягчения риска деградации РНК. Еще одним ограничением является относительно небольшой выборки размер, используемый для статистических расчетов. В будущем исследования, увеличивая размер выборки должен уменьшить последствия колебаний выражение гена и Мирна среди отдельных животных.

В интересах LCM реализуется в трансляционной геномных исследований с использованием животных моделей болезней человека и больной ткани20,21,22,23. Без возможности захвата определенных клеточных популяций транскрипционный анализ профиля различных мозга будет непостижим и неразборчивый смесь многих типов клеток. Использование LCM методов исследования мозга травмы привело к текущие усилия для разграничения мозга регионе конкретных биомаркеров и понять, как они соотносятся с циркулирующим биомаркеров TBI.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы признать Элизабет Sumner за ее помощь, редактирование этой рукописи. Финансирование этого проекта была оказана в части Moody проектом для трансляционного травматических повреждений исследования мозга и RO1NS052532 HLH.

Materials

Arcturus Laser Capture Microdissection System Applied Biosystems (Life Technologies)
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA
Agilent 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1513
Arcturus PEN Membrane Glass Slides  Applied Biosystems (Life Technologies) LCM0522
Capsure LCM caps Applied Biosystems (Life Technologies) LCM0211/LCM0214
Cresyl Violet Acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
Xylene (Histological grade) Fisher Scientific X3P-1GAL
Ethanol 200 proof (Histological grade) UTMB Pharmacy
RNAqueous Micro- Kit Life Technologies (Ambion) AM1931
Taqman Gene Expression Primer/Probes Applied Biosystems (Life Technologies) 4331182
Taqman microRNA Expression Primer/Probes Applied Biosystems (Life Technologies) A25576
Lightcycler 96 System Roche
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
  2. Mills, J. D., et al. Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe. PLoS One. 8 (10), e78480 (2013).
  3. Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future. J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).
  4. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).
  5. Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
  6. Rojo, D. R., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS.One. 6 (8), e23111 (2011).
  7. Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).
  8. Shearer, J., et al. Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury. Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).
  9. Caeyenberghs, K., et al. Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients. Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).
  10. Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy. Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).
  11. Karatsoreos, I. N. Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health. Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).
  12. Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., Hörtnagl, H., Pitkänen, A., Sperk, G. Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury. Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).
  13. Huusko, N., Pitkanen, A. Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI. Neuroscienze. 267, 30-45 (2014).
  14. Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2013).
  15. Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).
  16. Hellmich, H. L., et al. Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury. PLoS.One. 8 (1), e53230 (2013).
  17. Boone, D. R., et al. Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury. PLoS.One. 10 (5), e0127287 (2015).
  18. Boone, D. R., et al. Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock. PLoS.One. 7 (10), e46204 (2012).
  19. Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury. Brain Res. 1533, 122-130 (2013).
  20. Hellmich, H. L., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
  21. Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer’s disease. Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).
  22. Elstner, M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
  23. Wang, S., et al. Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors. BMC.Genomics. 11, 163 (2010).

Tags

Stereotactic AtlasLaser Capture MicrodissectionTraumatic Brain InjuryFrontal CortexHippocampusMolecular AnalysisTranscriptional AnalysisCryostatOptimal Cutting Temperature MediumBrain RegionsCell Types

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Weisz, H. A., Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury. J. Vis. Exp. (127), e56134, doi:10.3791/56134 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image