We beschrijven het gebruik van laser vangt microdissection te verkrijgen van monsters van afzonderlijke cel populaties van verschillende hersengebieden gen en microRNA p.a.. Deze techniek maakt het mogelijk de studie van Differentiele effecten van traumatische hersenenverwonding in bepaalde gebieden van de hersenen van de rat.
De mogelijkheid om te isoleren van de specifieke hersengebieden van belang kan worden belemmerd in weefsel scheiding technieken die niet hun ruimtelijke distributie kunnen behouden. Dergelijke technieken scheef mogelijk ook gen expressie analyse omdat het proces zelf kan expressiepatronen in afzonderlijke cellen wijzigen. Hier beschrijven we een laser vangt microdissection (LCM) methode om selectief verzamelen specifieke hersengebieden beïnvloed door traumatisch hersenletsel (TBI) met behulp van een gemodificeerde Nissl (cresyl violet) kleuring protocol en begeleiding van een rat hersenen atlas. LCM biedt toegang tot hersengebieden in hun oorspronkelijke posities en de mogelijkheid om gebruik van anatomische monumenten voor de identificatie van elke specifieke regio. Te dien einde is LCM eerder te onderzoeken van de hersenen regio specifieke genexpressie in TBI gebruikt. Dit protocol kan onderzoek van TBI-geïnduceerde veranderingen in gen en microRNA expressie in verschillende hersengebieden binnen hetzelfde dier. De beginselen van dit protocol kunnen worden gewijzigd en worden toegepast op een breed scala van studies die onderzoeken genomic expressie in andere ziekte en/of dierlijke modellen.
De hersenen van zoogdieren is opmerkelijk complexe en heterogene met honderden tot duizenden cel typen1. Inderdaad, menselijke studies hebben aangetoond dat in regio’s zoals de frontale cortex, structurele en functionele verschillen in witte en grijze kwestie worden weerspiegeld in de verschillende en uiteenlopende transcriptionele profiel2. Heterogeniteit van de hersenen is een groot obstakel voor het interpreteren van gen expressie gegevens en op het gebied van hersenletsel. Deze dubbelzinnigheid in preklinische studies heeft vervolgens geleid tot honderden mislukte klinische proeven van behandelingen voor hersenen schade3.
We gebruiken laser vangt microdissection (LCM) methoden voor de analyse van traumatisch hersenletsel (TBI)-geïnduceerde gene disregulatie in de rat hersenen4, gericht op de hippocampus, een regio van de hersenen dat essentieel is voor leren en geheugen5. De mogelijkheid om de laser vastleggen en analyseren van genexpressie in zowel sterven en het overleven van de neuronen geeft ons een beter begrip van de rol van onzekerheden in genexpressie bij de bepaling van het resultaat (neuronale overleving) na TBI6. LCM technieken zijn ook nuttig voor het verkennen van de effecten van TBI op hippocampal neuronen bij het vergelijken van veroudering en jonge muizen7 of ratten8gebleken.
In recente studies onderzochten we andere delen van de hersenen van de rat nadelig beïnvloed door TBI, met een focus op gebieden in ratten en menselijke TBI patiënten die gekoppeld aan de uitvoerende macht (d.w.z. frontale cortex9) en TBI comorbidities zijn; Deze comorbidities omvatten depressie (d.w.z. nucleus accumbens10) en circadiane ritme stoornissen (suprachiasmatic kern11). In eerdere studies, Huusko en Pitkanen12 en Drexel et al. 13 gebruikt LCM te onderzoeken van genexpressie in de thalamus en de hypothalamus. Onze studie bouwt voort op deze voorafgaande opmerkingen en omvat vier andere hersengebieden. Om te bestuderen van de land / regiospecifieke moleculaire veranderingen na TBI, bleek het noodzakelijk te winnen van deskundigheid bij het identificeren en verkrijgen van celtypes in deze regio’s met behulp van een systeem van de LCM. De UV-snij- en infrarood (IR)-lasers zijn voorzien van nauwkeurige microdissection van gewenste hersengebieden. Hier beschrijven we hoe we dit systeem van LCM, begeleid door stereotaxic coördinaten in de rat hersenen atlas14, om te identificeren en laser vangen vier rat hersengebieden die differentieel worden beïnvloed door de experimentele vloeistof-percussion hersenen letsel methode gebruiken 4.
Voor moleculaire studies van de zoogdieren hersenen, LCM uitgegroeid tot een essentiële techniek. Dit artikel toont aan dat het gebruik van de combinatie van de IR- en UV-snijden lasers in de LCM systeem genomic veranderingen in elke regio van de hersenen van zoogdieren kan slaan. Deze regio’s behoren die identificeerbare met conventionele LCM-compatibele vlekken, zoals cresyl violet of haematoxyline en eosine. De snelheid van de laser-opnameproces en het vermogen om te voeren LCM op dikkere 30 µm secties op PEN membraan dia’s maakt niet alleen het verkrijgen van voldoende hoeveelheden van celsteekproeven, maar ook om te isoleren van RNA van LCM monsters van een geschikte kwaliteit voor alle soorten downstream genomic analyse; deze analyses zijn microarrays16, PCR matrices17en kwantitatieve real-time PCR18.
Onze gegevens geven een reden voor studies die gebruik maken van de LCM weefsel. Wij vinden dat miR-15b is upregulated in de hippocampus en de cortex (Figuur 4), maar werden in de nucleus accumbens en biologisch belang aan het begrip van Differentiele effecten van TBI in de hersenen kan zijn. Een eerdere studie suggereerde dat stijgingen van de corticale neuronale kwetsbaarheid voor letsel het gevolg zijn van overexpressie van verschillende miRNAs die pro-overleving genen, zoals Bcl-219negatief te regelen. Doel scan analyse toont Bcl-2 wordt ook geregeld door miR-15b; Dus, onze gegevens suggereren een mechanistische verklaring voor waarom bepaalde gebieden van de hersenen (d.w.z., FCx) mogelijk selectief kwetsbaar voor TBI. Het is belangrijk om te onthouden van de meeste genen worden gereguleerd door meerdere miRNAs en correleren veranderingen in elke één miRNA aan een specifiek doel-gen is moeilijk. Bovendien, deze gegevens aangeven dat bepaalde wijzigingen in gen en microRNA expressie kunnen worden gebruikt als biomarkers voor land / regiospecifieke hersenbeschadiging. Inderdaad, we zijn momenteel met behulp van deze gegevens in studies van hoe nieuwe neuroprotectieve drug verbindingen met Antidepressivum eigenschappen differentieel gen en microRNA expressie in hersengebieden gekoppeld aan neuropsychiatrische aandoeningen kunnen beïnvloeden. Een beperking van onze studie is dat tijdens de verschillende stappen van dia preparatietechnieken voor LCM, RNA integriteit kan worden aangetast. Dit protocol beschrijft de nodige maatregelen ter beperking van het risico van aantasting van het RNA. Een andere beperking is de grootte van de relatief kleine steekproef gebruikt voor statistische berekening. In de toekomst moeten studies, verhoging van de grootte van steekproef verminderen de effecten van variaties in de gene en miRNA de expressie tussen de individuele dieren.
Het voordeel van LCM is gerealiseerd in translationeel genomic studies met diermodellen van ziekten bij de mens en zieke weefsels20,21,22,23. Zonder de mogelijkheid om vangen specifieke cel populaties, zou de transcriptionele profielen van verschillende hersengebieden een onkenbaar en onleesbaar mix van vele celtypes. Met behulp van LCM methoden in hersenen letsel studies heeft geleid aan de huidige inspanningen af te bakenen hersenen regio specifieke biomarkers en te begrijpen hoe zij correleren met de circulerende biomarkers van TBI.
The authors have nothing to disclose.
Wij willen erkennen van Elizabeth Sumner voor haar hulp dit manuscript bewerken. Financiering voor dit project was voorzien in deel van The Moody Project translationeel traumatische hersenonderzoek letsel en RO1NS052532 naar HLH.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |