في المختبر توصيف الخصائص الكهربية لألياف الزبائ Colonic في الفئران
Summary
وظيفة حسية غير طبيعية وراء الألم الحشوي وغيرها من أعراض الأمراض الوظيفية والتهاب الأمعاء. ويرد هنا بروتوكولا لتسجيل الكهربية للأعصاب الزبائ colonic في استعداد كولوريكتوم الفئران السابقين فيفو .
Abstract
الخلل الوظيفي للأعصاب الحسية colonic متورط في الفسيولوجيا المرضية للعديد من الشروط المشتركة، بما في ذلك الأمراض الوظيفية والتهاب الأمعاء ومرض السكري. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتوصيف الخصائص الكهربية من أفيرينتس colonic في الفئران في المختبر . كولوريكتوم، مع العقدة الحوض سليمة (PG) المرفقة، يتم إزالة من الفئران؛ سوبيرفوسيد مع كاربوجيناتيد الحل كريبس في قاعة التسجيل؛ ومقني في نهايات عن طريق الفم والشرج للسماح بانتفاخ. يتم تعريف حزمة الأعصاب دقيقة النابعة من فريق البرمجة، ويتم تسجيل نشاط العصب الزبائ مولتيونيت قطب شفط باستخدام. يتسبب انتفاخ الجزء colonic زيادات تدريجية في تصريف مولتيونيت. ويجري تحليل عنصر الرئيسي التفريق عتبة المنخفضة والعالية-العتبة الألياف الزبائ دينامية واسعة المدى. يمكن دراسة حساسية أفيرينتس colonic الكيميائية من خلال إدارة المركبات اختبار حمام أو إينترالومينال. يمكن تعديل هذا البروتوكول للتطبيق على الأنواع الأخرى، مثل الفئران وخنازير غينيا، ودراسة الاختلافات في الخصائص الكهربية من أفيرينتس ما/هيبوجاستريك ولومبوساكرال/الحوض القولون تنازلي في العادي و الحالات المرضية.
Introduction
الجهاز الهضمي (GIT) هو معصب غنية بالاعصاب الزبائ الخارجية التي تنقل الإشارات الحسية من الأمعاء إلى الجهاز العصبي المركزي والتي تساهم في تفاعل القناة الهضمية في الدماغ. استثارة غيرت من هذه أفيرينتس الخارجية، وكذلك المعالجة المركزية غيرت المدخلات الزبائ، يكمن وراء الألم الحشوي وأعراض أخرى لظروف غي، بما في ذلك الأمراض الوظيفية والتهاب الأمعاء1. وينقل المعلومات الحسية من كولوريكتوم الدرجة الأولى من خلال ما/هيبوجاستريك و لومبوساكرال/الحوض الأعصاب (PN)2. كان هناك زيادة اهتمام بدراسة الخصائص الكهربية لهذه الألياف الزبائ الأولية في نماذج القوارض من المرض. ومع ذلك، في فيفو التسجيلات الكهربية من أفيرينتس colonic في القوارض تحديا تقنيا ويتطلب قدرا كبيرا من المهارات الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، قد التغييرات الفسيولوجية وحركة الأنسجة والمسكنات أيضا تؤثر على نشاط العصب وحساسية لاختبار المنشطات في فيفو. ولذلك، في السنوات الأخيرة، استخدمت عددا متزايداً من الدراسات في المختبر (السابقين فيفو) الاستعدادات من مختلف الأنواع، بما في ذلك الفئران، الجرذان وخنازير غينيا والبشر، لدراسة آليات توصيل الحسي في colonic أفيرينتس واستثارة غيرت في ظروف المرض. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
وأفيد أساسا نوعين من إعداد colonic السابقين فيفو :9،،من5إعداد “ورقة مسطحة”10 و3،4إعداد “الأنبوب”. وكان بروتوكول فيديو لإعداد “ورقة مسطحة” كولوريكتوم موريني المنشورة سابقا11. في هذا البروتوكول، كولوريكتوم الماوس، مع PN) أو سبلانتشنيك الأعصاب القطنية (LSN) المرفقة، المقطوع وسوبيرفوسيد في غرفة لانسجة. كولوريكتوم هو قطع مفتوحة طوليا، ويتم توسيع الحزمة العصبية في حجرة تسجيل مملوءة بزيت البارافين. يتم تسجيل نشاط العصب استخدام قطب البلاتين الايريديوم أحادي القطب. يسمح البروتوكول للتعرف على مجالات تقبلا من ألياف الزبائ الفردية باستخدام التحفيز الكهربائي غير متحيزة. أنه يموضع تطبيق المحفزات الكيميائية، وكذلك تطبيق نماذج مختلفة من التحفيز الميكانيكية (مثل تنسيق المخاطية السبر وتمتد كفافى)، إلى النهايات العصبية الزبائ. لأنه يجب أن تمدد العصب إلى غرفة منفصلة من قاعة النسيج، من الأهمية بمكان للحفاظ على العصب المرفقة طويلة نسبيا؛ تشريح ناجحة للأعصاب يشكل تحديا لأولئك جديدة لهذه المنهجية. في الآونة الأخيرة، نشرت نلينس et al. بروتوكول فيديو للتسجيل في المختبر أفيرينتس المساريقي العلوي في jejunal مورين وشرائح colonic12. في هذا الإعداد “أنبوب”، يتم الاحتفاظ الجزء الغريزي مع مساريق المرفقة سليمة، وبالتالي السماح لانتفاخ متدرج ولومينال داخل وخارج إدارة المواد الكيميائية المختلفة. منذ العصب مساريق يتم تسجيلها باستخدام قطب كهربائي شفط، الذي يمكن وضعه قريبا من الأنسجة، يمكن تسجيل النشاط الزبائ حتى ولو العصب مساريق قصيرة نسبيا. إلا أن العصب مساريق يتكون من المختلطة السكان من ألياف الزبائ تحفيزه والعمود الفقري الذي يعصب الصائم أو ما هيبوجاستريك. أفيرينتس الحوض Lumbosacral يعصب كولوريكتوم، الذي لا يميز في هذا البروتوكول. نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتسجيل الكهربية أفيرينتس colonic الفئران باستخدام إعداد كولوريكتوم “أنبوب” مع صفحة سليمة قد يسمح هذا الأسلوب لتوصيف الخصائص الوظيفية قطني سبلانتشنيك (هيبوجاستريك) والحوض أفيرينتس لومبوساكرال.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المعروضة هنا أسلوب تجريبي بسيط نسبيا لتقييم الخصائص الكهربية من أفيرينتس colonic من الفئران. البروتوكول (من تشريح الأنسجة بإعداد تسجيل العصب) عادة ما يستغرق حوالي 2 ساعة لإكمال. جمع الأنسجة (الخطوة 3) وإعداد مسرى الشفط (الخطوة 5) هي الخطوات الحاسمة. من الأهمية بمكان أن تكون قادراً على…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البروتوكول المنح البحثية “الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين” (#31171066, #81270464) ومركز العلوم الصينية-الألمانية (GZ919).
Materials
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
Riferimenti
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3. r. d., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscienze. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
