L'isolement des myoblastes humains, l'évaluation de la différenciation myogénique et la mesure de l'entrée de calcium par magasin
Summary
Ici, nous décrivons une méthodologie pour obtenir une population pure de myoblastes humains à partir d'un tissu musculaire adulte. Ces cellules sont utilisées pour étudier la différenciation in vitro des muscles squelettiques et, en particulier, pour étudier les protéines impliquées dans la signalisation du Ca 2+ .
Abstract
Les cellules satellites (SC) sont des cellules souches musculaires situées entre la membrane plasmique des fibres musculaires et la lame basale environnante. Ils sont essentiels pour la régénération musculaire. En cas de blessure, qui se produit fréquemment dans les muscles squelettiques, les SC sont activés. Ils prolifèrent comme myoblastes et se différencient pour réparer les lésions musculaires. Parmi les nombreux événements qui se déroulent lors de la différenciation musculaire, les signaux cytosoliques de Ca 2+ sont d'une grande importance. Ces signaux Ca 2+ proviennent de la libération de Ca de Ca 2+ magasins internes, ainsi que de Ca 2+ entrée de l'espace extracellulaire, en particulier l'entrée Ca 2+ magasin fonctionnant (SOCE). Cet article décrit une méthodologie utilisée pour obtenir une population pure de myoblastes humains à partir d'échantillons musculaires recueillis après la chirurgie orthopédique. Le tissu est digéré mécaniquement et enzymatiquement, et les cellules sont amplifiées puis triées par cytométrie en flux selon la présence de spécimensMarqueurs de membrane de fic. Une fois obtenu, les myoblastes humains sont élargis et s'engagent à se différencier en éliminant les facteurs de croissance du milieu de culture. Les niveaux d'expression des facteurs de transcription spécifiques et de l' immunofluorescence in vitro sont utilisés pour évaluer le processus de différenciation myogénique dans les conditions de contrôle et après le silence des protéines impliquées dans la signalisation du Ca 2+ . Enfin, nous détaillons l'utilisation de Fura-2 comme une sonde ratiométrique Ca 2+ qui fournit des mesures fiables et reproductibles de SOCE.
Introduction
Les muscles squelettiques humains sont composés de groupes de fibres musculaires contractiles et multinucléées résultant de la fusion des cellules précurseurs myogéniques. Les muscles squelettiques ont la capacité de se régénérer après une blessure grâce à la présence de SC, les cellules souches du muscle squelettique situées entre la membrane plasmatique des myofibres (sarcolemma) et la lame basale. Dans les muscles non blessés, les SC sont principalement présents dans un état de repos. En réponse au stress mécanique ou aux blessures, les SC sont activés (myoblastes), prolifèrent et subissent soit une différenciation pour former de nouvelles myofibres, soit un auto-renouvellement pour reconstituer le pool SC 1 , 2 . Au cours des années, plusieurs techniques ont été développées pour isoler les SC et leur descendance, les myoblastes, à partir des biopsies des muscles squelettiques. Avec une meilleure compréhension des marqueurs de surface cellulaire exprimés sur ces cellules et de la méthodologie du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 3, 4 , 5 , il est maintenant possible d'isoler des populations pures de myoblastes humains à partir d'échantillons musculaires.
La signalisation de calcium régule le développement du muscle squelettique, l'homéostasie et la régénération. En particulier, l'entrée Ca 2+ qui est activé suite à l' épuisement du magasin intracellulaire, appelé SOCE, est d' une grande importance pour 6 ces processus. Lors de la stimulation cellulaire, le niveau de Ca 2+ dans le réticulum endo / sarcoplasmique (ER / SR) diminue, ce qui active les canaux Ca 2+ de la membrane plasmatique qui permettent l'entrée de Ca 2+ pour remplir le ER / SR 7 . Les deux principales protéines impliquées dans SOCE sont la protéine de l'interaction ERR / SR Ca 2+ -sensing stromal interaction molécule 1 (STIM1) et la chaîne plasma Ca 2+ canal Orai1. Le muscle squelettique exprime abondamment ces deux protéines, ainsi que d'autres protéines des mêmes familles (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 et plusieurs canaux perméables au Ca 2+ de la famille canonique canonique (TRPC) du récepteur transitoire 10 , 11 , 12 , 13 . L'entrée de Ca 2+ à travers la voie SOCE revêt une grande importance pour la formation / régénération musculaire 14 . Les mutations des protéines STIM1 ou Orai1 ont des effets délétères sur la fonction musculaire, conduisant principalement à l'hypotonie musculaire 15 . Les modèles animaux avec déficience de SOCE présentent également une masse musculaire et une force réduites, ainsi qu'une fatigabilité accrue 6 , 16 , 17 . Comme mentionné, d'autres protéines STIM et Orai, ainsi que de nombreux canaux TRPC, sont exprimés dans le muscle squelettique, et leurs rôles respectifs n'ont pas encore été déterminés jusqu'à présent. En battant dPossèdent leur niveau d'expression, il est ainsi possible d'étudier leurs implications dans SOCE et leurs rôles lors de la différenciation des muscles squelettiques humains.
La mesure SOCE peut être effectuée en utilisant deux approches différentes: enregistrements électrophysiologiques actuels et mesures Ca 2+ . L'électrophysiologie est certainement une méthode plus directe, car elle mesure le courant d'intérêt et sa signature électrophysiologique associée. Cependant, cette technique est très difficile à appliquer aux cellules musculaires, principalement en raison de la grande taille des cellules musculaires et de la petite taille du courant endogène de la SOCE. L'imagerie cytosolique Ca 2+ est techniquement très accessible, mais la mesure est plus indirecte, car le niveau de Ca 2+ mesuré dans le cytosol reflète à la fois l'entrée de Ca 2+ et le refoulement de la cellule ou dans les magasins internes.
Une méthodologie qui comprend l'isolement des myoblastes à partir de petits morceaux de skel humainEtal après digestion enzymatique, amplification et FACS est expliqué dans cet article. Le processus de différenciation musculaire et le protocole d'immunofluorescence pour suivre l'expression de marqueurs de différenciation dans le temps sont décrits 18 . Enfin, la mesure de SOCE et le rôle de différents canaux ioniques dans la signalisation Ca 2 + et la différenciation musculaire squelettique sont expliqués.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'isolement et la culture des myoblastes humains à partir du muscle squelettique adulte offrent un modèle in vitro pour étudier la différenciation musculaire et la régénération musculaire. Dans cet article, nous fournissons un protocole qui permet de purifier les rendements élevés de myoblastes humains d'une manière simple et limitée en termes de coûts. En outre, cette technique fournit des résultats fiables et reproductibles en termes de pourcentage de myob…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale suisse de la science (numéro 310030-166313), la Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires, la Fondation Marcel Levaillant et la Fondation pour la recherche ostéo-articulaire.
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
Riferimenti
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
