인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

인간 골격근은 근원 전구 세포의 융합으로 인한 수축성 다핵 근육 섬유 군으로 구성됩니다. 골격 근육은 근섬유 (원형질막)의 원형질 막과 기저 층 (basal lamina) 사이에 위치한 골격근 줄기 세포 인 SC의 존재로 인해 손상 후 재생성 할 수 있습니다. 손상되지 않은 근육에서 SC는 주로 정지 상태에 있습니다. 기계적 스트레스 나 부상에 반응하여 SC는 활성화되고 (myoblast), 증식하고, SC pool ^{1 , 2} 를 보충하기 위해 새로운 myofibers를 형성하기 위해 분화되거나 자체 갱신됩니다. 수년에 걸쳐 골격근 생검에서 SC 및 그 자손 인 myoblast를 분리하기위한 몇 가지 기술이 개발되었습니다. 이 세포들에 표현 된 세포 표면 마커들과 형광 – 활성화 세포 분류 (FACS) ³ 의 방법론에 대한 더 깊은 이해로^{, 4 , 5} , 이제 근육 샘플로부터 인간 근섬유의 순수 집단을 분리하는 것이 가능합니다.

칼슘 시그널링은 골격근 발달, 항상성 및 재생을 조절합니다. 특히, SOCE라는 세포 내 저장 고갈 다음 활성화되는 칼슘 ^{2 +} 항목은 이러한 프로세스에 대한 중요성 ^6이다. 세포 자극시 endo / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)의 Ca ²⁺ 수준이 감소하고 세포막 칼슘 ^이온 채널을 활성화시켜 Ca ²⁺ 유입을 허용하여 ER / SR ⁷ 을 충전합니다. SOCE에 관여하는 두 가지 주요 단백질은 ER / SR Ca ^{2+ –} 감지 간질 상호 작용 분자 1 (STIM1) 단백질과 원형질막 Ca ²⁺ 채널 Orai1입니다. 골격 근육은이 두 단백질과 같은 가족의 다른 단백질을 풍부하게 표현합니다 (STIM2 and Orai2-Orai3) ^{8 , 9} 및 transient receptor potential canonical (TRPC) 계열 ^{10 , 11 , 12 , 13의} Ca ²⁺ 투과성 채널. SOCE 경로를 통한 Ca ²⁺ 유입은 근육 형성 / 재생에 매우 중요합니다 ¹⁴ . STIM1 Orai1 또는 단백질 돌연변이 근육 긴장 저하 ^(15)을 중심으로 이어지는 근육 기능에 해로운 영향을 미친다. SOCE 손상이있는 동물 모델은 또한 근육 질량과 힘을 감소시키고, 피로도를 ^{6 , 16 , 17} 로 향상시킵니다. 언급 한 바와 같이, 다른 TRP 채널뿐만 아니라 다른 STIM 및 Orai 단백질은 골격근에서 발현되며, 각각의 역할은 지금까지 결정되지 않았다. 노크 d함으로써그들의 발현 수준을 소유하고 있기 때문에 SOCE에서의 함의와 인간 골격근에서의 역할을 조사 할 수 있습니다.

SOCE 측정은 전기 생리 학적 전류 기록과 Ca ²⁺ 측정의 두 가지 접근법을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 전기 생리학은 확실히 현재의 관심과 그에 관련된 전기 생리 학적 신호를 측정하기 때문에보다 직접적인 방법입니다. 그러나,이 기술은 근육 세포에 적용하기가 매우 어렵습니다. 주로 근육 세포의 크기가 크고 내인성 SOCE 전류가 작기 때문입니다. 세포질 ^칼슘 촬상 기술적으로 매우 접근이지만, 세포질에서 측정 된 Ca2 ⁺ 수준의 칼슘의 유입 ²⁺ 및 재 펌핑 셀로부터 또는 내부 저장에 모두 반영 같이 측정은 간접적이다.

인간의 뼈의 작은 조각으로부터 myoblasts를 분리하는 것을 포함하는 방법론효소 소화, 증폭 및 FACS 후 etal 근육이이 종이에 설명되어 있습니다. 시간이 지남에 따라 차별화 마커의 표현을 따르는 근육 차별화 및 면역 형광 프로토콜의 과정은 ¹⁸ 에 설명되어 있습니다. 마지막으로, SOCE의 측정과 칼슘 ^{2 +} 신호 및 골격근 분화에 다른 이온 채널의 역할이 설명되어 있습니다.