Her beskriver vi en metode for å oppnå en ren populasjon av humane myoblaster fra voksen muskelvev. Disse cellene brukes til å studere in vitro skjelettmuskeldifferensiering og spesielt å studere proteiner involvert i Ca 2+ -signalering.
Satellittceller (SC) er muskelstamceller plassert mellom plasmamembranen i muskelfibre og den omkringliggende basale lamina. De er essensielle for regenerering av muskler. Ved skade, som ofte forekommer i skjelettmuskler, aktiveres SC. De sprer seg som myoblaster og skiller seg for å reparere muskellesjoner. Blant mange hendelser som skjer under muskeldifferensiering, er cytosoliske Ca 2+ signaler av stor betydning. Disse Ca 2+ -signalene oppstår fra Ca 2+ -frigjøring fra interne Ca 2+ -butikker, samt fra Ca 2+ -oppføring fra det ekstracellulære rommet, særlig den store opererte Ca 2+ -inngangen (SOCE). Dette papiret beskriver en metode som brukes til å oppnå en ren populasjon av humane myoblaster fra muskelprøver samlet etter ortopedisk kirurgi. Vevet blir mekanisk og enzymatisk fordøyd, og cellene blir amplifisert og deretter sortert ved hjelp av flytcytometri i henhold til tilstedeværelsen av speciFic membran markører. Når man er oppnådd, blir menneskelige myoblaster utvidet og forpliktet til å differensiere ved å fjerne vekstfaktorer fra kulturmediet. Ekspresjonsnivåene av spesifikke transkripsjonsfaktorer og in vitro immunfluorescens brukes for å vurdere den myogene differensieringsprosessen i kontrollbetingelser og etter siling av proteiner involvert i Ca 2+ -signalering. Endelig beskriver vi bruken av Fura-2 som en ratiometrisk Ca 2+ -probe som gir pålitelige og reproducerbare målinger av SOCE.
Menneskeskelettmuskulaturen består av grupper av kontraktile multinukleerte muskelfibre som er resultatet av fusjon av myogene forløperceller. Skelettmuskler har evne til å regenerere etter skade takket være forekomsten av SC, skjelettmuskelstamceller som ligger mellom plasmamembranen av myofibere (sarcolemma) og basallamina. I ubeskadigede muskler er SCs for det meste tilstede i en sovende tilstand. Som respons på mekanisk stress eller skade blir SCs aktivert (myoblaster), proliferere og undergå enten differensiering for å danne nye myofibere eller selvfornyelse for å fylle opp SC-bassenget 1 , 2 . Gjennom årene ble flere teknikker utviklet for å isolere SC og deres avkom, myoblaster, fra skjelettmuskelbiopsier. Med større forståelse av celleoverflate markørene uttrykt på disse cellene og metoden for fluorescensaktivert cellesortering (FACS) 3, 4 , 5 , er det nå mulig å isolere rene populasjoner av humane myoblaster fra muskelprøver.
Kalsiumsignaler regulerer skjelettmuskelutvikling, homeostase og regenerering. Spesielt er Ca 2+ -inngangen som aktiveres etter intracellulær butikkutslipp, kalt SOCE, av stor betydning 6 for disse prosessene. Ved cellestimulering reduseres Ca 2+ -nivået i endo / sarcoplasmisk retikulum (ER / SR), som igjen aktiverer plasmamembran Ca 2+ -kanaler som tillater Ca 2+ -oppføring å fylle ER / SR 7 igjen . De to hovedproteinene som er involvert i SOCE er ER / SR Ca 2+ -sensingstromal-interaksjonsmolekylet 1 (STIM1) -proteinet og plasmamembranen Ca 2+ -kanalen Orai1. Skjelettmuskulatur uttrykker i stor grad disse to proteinene, så vel som andre proteiner av samme familie (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 og flere Ca 2+ -permeable kanaler i den transiente reseptorpotensialkanoniske familien (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ oppføring gjennom SOCE-banen er av stor betydning for muskeldannelse / regenerering 14 . Mutasjoner av STIM1- eller Orai1-proteiner har skadelige virkninger på muskelfunksjon, som hovedsakelig fører til muskelhypotoni 15 . Dyremodeller med SOCE-svekkelse viser også redusert muskelmasse og kraft, sammen med forbedret tretthet 6 , 16 , 17 . Som nevnt uttrykkes andre STIM- og Orai-proteiner, så vel som mange TRPC-kanaler, i skjelettmuskulaturen, og deres respektive roller har ikke blitt bestemt til nå. Ved å banke på dEier deres uttrykksnivå, er det således mulig å undersøke deres implikasjoner i SOCE og deres roller under human skjelettmuskulær differensiering.
SOCE måling kan utføres ved hjelp av to forskjellige tilnærminger: elektrofysiologiske nåværende opptak og Ca 2+ målinger. Elektrofysiologi er absolutt en mer direkte metode, da den måler gjeldende interesse og tilhørende elektrofysiologisk signatur. Denne teknikken er imidlertid svært vanskelig å bruke på muskelceller, hovedsakelig på grunn av muskelcellens store størrelse og den lille størrelsen på den endogene SOCE-strømmen. Cytosolisk Ca 2+ avbildning er teknisk svært tilgjengelig, men målet er mer indirekte, da Ca 2+ -nivået målt i cytosolen reflekterer både opptaket av Ca 2+ og repumping ut av cellen eller i de interne butikkene.
En metode som inkluderer isolering av myoblaster fra små biter av menneskeskallEtalmuskel etter enzymatisk fordøyelse, amplifikasjon og FACS er forklart i dette papiret. Prosessen med muskeldifferensiering og immunfluorescensprotokollen for å følge uttrykket av differensieringsmarkører over tid er beskrevet 18 . Til slutt forklares målingen av SOCE og rollen av forskjellige ionkanaler i Ca 2+ signalering og skjelettmuskeldifferensiering.
Isoleringen og kulturen av humane myoblaster fra voksen skjelettmuskel tilbyr en in vitro- modell for å studere muskeldifferensiering og muskelregenerering. I dette papiret gir vi en protokoll som muliggjør rensing av høye utbytter av humane myoblaster på en enkel og kostnadsbegrenset måte. I tillegg gir denne teknikken pålitelige og reproducerbare resultater i prosent av myoblaster isolert og deres myogene differensieringseffektivitet. Faktisk oppnådde vi rundt 60% av hu…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (bevilgningsnummer 310030-166313), "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Stiftelsen Marcel Levaillant" og "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire."
Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
BSA | Sigma | O5482 | |
fetuin | Sigma | F3385 | |
EGF | Corning | 354001 | |
Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
Insulin | Sigma | I9278 | |
Creatine | Sigma | 27900 | |
Pyruvate | Sigma | P4562 | |
Uridine | Sigma | U3003 | |
Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
Mounting medium | Fluka | 10981 | |
Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
* : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |