We beschrijven een nieuwe experimentele techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME), die is gebaseerd op het bewijsmateriaal bellen dat skelet spierweefsel levensvatbare myogenic cellen, die vergemakkelijken donor-cel-gemedieerde myogenesis bevat kunnen wanneer ingeplant een host spier.
Skeletspieren bezit regeneratief vermogen als gevolg van weefsel-ingezeten, spier vezel-genererende (myogenic) satelliet cellen (gcv), die nieuwe spiervezels onder de juiste omstandigheden kan vormen. Hoewel SCs kunnen worden geoogst van spierweefsel en in vitro gekweekt, zijn de resulterende myoblast cellen niet zeer effectief in het bevorderen van myogenesis als in host spier getransplanteerd. Operatief bloot van de host-spier en enten van segmenten of donor spierweefsel, de geïsoleerde spiervezels met hun SCs op host spier, bevordert betere myogenesis in vergelijking met myoblast transplantatie. We hebben een nieuwe techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME noemen) ontwikkeld. MIME omvat het passeren van een chirurgische naald door de host-spier, tekening van een stuk van donor spierweefsel via de naald weg en dan het verlaten van het donorweefsel die is ingesloten in de host-spier, zodat het als een bron van SCs voor de host spier fungeren kan. Hier beschrijven we in detail de stappen betrokken bij het uitvoeren van MIME in een immunodeficiëntie muismodel die een groen fluorescente proteïne (GFP) uitdrukt in alle van de cellen. Immuundeficiëntie in de host-muis vermindert het risico van immuun afwijzing van het donorweefsel en GFP expressie kunt gemakkelijke identificatie van de host spiervezels (GFP +) en de donor-cell-derived spiervezels (GFP-). Onze pilot gegevens suggereren dat MIME kan worden gebruikt om het implantaat een extensor digitorum longus (EDL) spier van de muis van een donor in de tibialis anterior (TA) spier van de muis van een host. Onze gegevens suggereren ook dat wanneer een myotoxin (bariumchloride, BaCl2) wordt geïnjecteerd in de host-spier na MIME, er bewijs van donor-cell-derived in de host-spier, met ongeveer 5%, 26%, 26% en 43% van de vezels in één host TA myogenesis is spier tonen geen host bijdrage, minimale host bijdrage, matige host bijdrage en maximale host bijdrage, respectievelijk.
Gezonde skeletspieren, alhoewel na mitotische, bezit uitstekende regeneratief vermogen als gevolg van de aanwezigheid van weefsel-ingezeten myogenic cellen bekend als satelliet cellen (gcv)1,2; en gerecenseerd in3,4. Echter, onder pathologische omstandigheden veroorzaakt door muscular dystrophie, trauma of versnelde veroudering, de regeneratie van de spier mogelijk niet bijbenen spier verdeling, en zo progressieve spiervezel verlies treedt op5. Hoewel het effectieve methoden zijn ontwikkeld om te isoleren van SCs van spier en hen uit te breiden in cultuur voor het genereren van grote aantallen myoblasts (en later myotubes), hebben pogingen voor het genereren van fysiologisch relevante nummers van spiervezels in host spier leverde slechts minimale succes6. Als met veel andere celtypen, doen wanneer myoblasts alleen worden ingespoten in gastheer weefsel, allermeest naar de cellen niet engraft7,8. We hebben aangetoond dat neuromusculaire elektrische stimulatie (NMES) vergemakkelijkt donor-cell-derived myogenesis in regeneratie-deficiënte host muis spier die werd ingespoten met menselijke myoblasts8. Anderen hebben aangetoond dat operatief praktijk biopsied spier of enkele spiervezels met bijgevoegde SCs, gematigde myogenesis zelfs zonder NMES, wat suggereert dat het implanteren van hele spiervezels met SCs voordeliger dan het implanteren wellicht vergemakkelijken myogenic cellen alleen9,10. Aangezien de donor of gemanipuleerde spierweefsel op host spier geënt betere resultaten produceert dan het transplanteren van cellen alleen, is het mogelijk dat weefsel of weefsel-achtige structuren cruciale aanwijzingen voor donor-cel engraftment geven kunnen; een concept dat is steeds duidelijker in celtherapie studies waarbij verschillende cel typen10,11,12.
Recente gegevens suggereren dat SCs verkregen mens meer dan 2 weken na het slachten myotubes in cultuur13 genereren. Daarom zullen wij beoordelen of innesteling van spier weefsel geoogst post mortem in een levende gastheer spiervezel verlies zal worden afgewikkeld. We hebben een nieuwe techniek genaamd MIME om het implantaat donor spierweefsel in skeletspieren weefsel van een levende gastheer ter bevordering van de donor-cell-derived myogenesis ontwikkeld. MIME impliceert het passeren van een chirurgische naald door de host spier maken een naald track; tekening van een klein segment van donor spierweefsel via de naald weg; verlaten van het donorweefsel ingebed in de spier van de gastheer; en sluiten de naald gaatjes met weefsel lijm. Nadat het beoefenen van de techniek in muizen euthanized studeerde in andere experimenten, we hebben nu uitgevoerd MIME in levende muizen die immunodeficiëntie en overal express een groen fluorescente proteïne (GFP) en follow-up op 3 en 14 dagen na MIME. 3 dagen na MIME bevestigen wij dat de donor muis (GFP-) EDL spier host muis (GFP +) TA spier, blijft ingebed in de spieren van de host ingeplant. Bij 14 dagen na MIME, bevestigen na BaCl2 myotoxin schade aan het veroorzaken van schade en myogenesis, wij dat ongeveer 5%, 26%, 26% en 43% van de vezels in één host TA spier geen host bijdrage, minimale host bijdrage, matige ontvangst bijdrage en maximale host bijdrage, respectievelijk. Centrale nucleatie (een marker van degeneratie en regeneratie van de latere) is te zien in ongeveer 95% van de spiervezels TA na injectie van MIME en myotoxin.
We bestuderen TA spieren 14 dagen na MIME + BaCl2 omdat dit punt van tijd de tussenfase van de regeneratie, vangt wanneer een meerderheid van de geregenereerde vezels zijn centraal nucleated. We bestuderen GFP + muizen als gastheer voor MIME, zodat wanneer we uiteindelijk transplantatie van menselijke dode foetussen spier in host muizen, zullen we kunnen gemakkelijk onderscheiden spiervezels van host- en donor oorsprong. We gebruiken de muis EDL spier als de experimentele donorweefsel, aangezien enkele vezels van deze spier is groter myogenic potentieel dan TA spieren9gebleken. De EDL spier is ook synergetische naar de TA-spier en heeft dezelfde type vezel samenstelling. Onze voorlopige gegevens suggereren dat MIME kunnen vergemakkelijken van donor-cell-derived myogenesis in de spier van de gastheer.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de nieuwe experimentele techniek die bekend staat als MIME, ontwikkeld in ons laboratorium, implantaat donor spierweefsel in host spierweefsel. Dit is een aanpassing van een open spier enten techniek die heeft bewezen effectief te zijn in het bevorderen van donor-cel-gemedieerde myogenesis in een host spier9,10,17.
Het doel van MIME is niet in te schakelen van de engraftment van de donor spierweefsel zelf in de spier van de host (op dit moment weten we niet als dit gebeurt), maar eerder om een bron van donor SCs die kunnen bijdragen aan de myogenesis in de spier van de host onder voorwaarden die m stimuleren uscle de regeneratie. Onze hoop is dat nadat MIME is geoptimaliseerd en getest in basis- en preklinisch onderzoek, het zou kunnen waardevolle inzichten om te begeleiden van klinische therapieën gericht bieden op het verhogen van de regeneratie van de spier in skeletspieren die myogenic spier verlies hebben ondergaan.
Er zijn tal van vragen die nog moeten worden beantwoord met betrekking tot hoe MIME kon worden vertaald in een klinische therapie, bijvoorbeeld: hoe zouden we de controle van de kwaliteit van het donorweefsel? Hoe zouden we immuun afwijzing van donor weefsels en cellen controleren? Is de donorweefsel uitgeschakeld na het verstrekken van cellen voor myogenesis of laat het achter een fibrotische litteken? Beïnvloedt de type vezel van donor en/of host spier de donor-cel-gemedieerde myogenesis? Welke spieren kunnen praktisch profiteren van MIME? We zijn momenteel onze studies om te beoordelen of MIME is veilig en effectief, het identificeren van adjuvante behandelingen die kunnen vergroten donor afkomstige myogenesis, en antwoord op veel van de vragen, bovengenoemde uitbreiden.
Na het voltooien van onze tests van muis-tot-muis allogene transplantatie met MIME, is onze volgende stap het uitvoeren van mens-tot-muis MIME met menselijk weefsel van dode foetussen om te evalueren van het myogenic potentieel van dode foetussen spierweefsel. Wij verwachten dat deze experimenten zal leiden tot een nieuwe lijn van fundamenteel en translationeel onderzoek, waarbij spierweefsel van donoren, die zijn ingeschreven in initiatieven zoals de Body legaat programma voor onderwijs en het programma van de Gift van het leven voor orgaandonatie .
De representatieve gegevens gepresenteerd in dit manuscript suggereren dat na 14 dagen na MIME, er zijn verschillende levensvatbare myofibers die gebrek aan GFP hetzij hebben lage niveaus van GFP. Onze interpretatie van deze gegevens is dat GFP-donor satelliet cellen aan de myogenesis in de spier van de gastheer bijgedragen. We dit experiment uitgevoerd ter voorbereiding van het implanteren van menselijk weefsel van dode foetussen in een host muis spier. Om aan te tonen ondubbelzinnig dat de donor satelliet cellen bijdragen aan myogenesis in de host-spier na MIME, zou het nuttig zijn om te inplanteren donorweefsel die een fluorescerende verslaggever, die kan gemakkelijk worden onderscheiden van GFP (b.v.uitdrukt, rood fluorescerend eiwit donorweefsel GFP + host spier ingeplant uitdrukken).
Deze techniek wordt vooral beperkt door de aard van de SCs aanwezig in de donorweefsel. Als de SCs in het donorweefsel levensvatbare, dat de techniek is waarschijnlijk ter vergemakkelijking van de donor-cel-gemedieerde myogenesis, terwijl als zijn ze niet rendabel, myogenesis zich niet voordoen. Aangezien echter SCs zijn zeer veerkrachtig en levensvatbaar is voor ongeveer 2 weken na het slachten, het is zeer waarschijnlijk dat voor experimentele doeleinden, het donorweefsel die is geïmplanteerd binnen een paar minuten na de oogst donor-cel-gemedieerde myogenesis13 vergemakkelijken zal . Bovendien, zoals zinspeelde op bovenstaande, is het mogelijk dat sinds het hele spierweefsel (dat bevat SCs, volwassen spiervezels, evenals spier-ingezeten fibroblasten) is ingebed in de host-spier, fibrose kan optreden. Deze veronderstelling moet echter worden empirisch onderzocht. De literatuur over spier schade ten gevolge van schadelijke contracties, cryoinjury en experimentele myotoxins, suggereert dat immuuncellen (voornamelijk macrofagen) kunnen effectief clearing cellulaire puin van de beschadigde vezels en het remodelleren van de extracellulaire matrix18. Het is daarom mogelijk dat na MIME en BaCl2 injectie, zolang de immuun cellen van de gastheer toegang tot degenererende donor spiervezels hebben, ze kon duidelijk puin, gewoon de donor SCs achterlatend. Ten slotte, de omvang van de donor-afgeleide myogenesis is afhankelijk van de hoeveelheid donor spierweefsel dat is ingebed in de spieren van de host. Om de host spier compartiment volledig tekstindex door donor-cell-derived myofibers, zou het een methode zoals X – of gamma-bestraling lasertherapie host spier SCs en ook vereisen herhaalde MIME procedures vereisen.
Het is aangetoond dat operatief bloot een host spier en wordt een stukje donorweefsel op de host-spier donor-cel-gemedieerde myogenesis9,10,17kunnen vergemakkelijken. Deze open chirurgische benadering heeft in het verleden is gebruikt voor het bijhouden van de voortgang van myogenesis en voor het genereren van Muismodellen van menselijke spier ziekten. Het innovatieve aspect van de MIME-techniek is dat het minimaal invasieve en houdt niet operatief bloot de host spier. Dit vermindert het risico van iatrogene infecties en de mate van ongemak in de host-dier, dus waardoor het meer haalbaar MIME herhaaldelijk op de dezelfde host spier uitvoeren indien nodig.
Wij verwachten dat de MIME-techniek een geschikte verfijning van de open chirurgische aanpak die momenteel wordt gevolgd wellicht om het implantaat donor spierweefsel in de muis van een host. Dit kan de generatie van gehumaniseerd muismodellen, versnellen door inbedding biopsied menselijke spier in de host muis spier. Bovendien, verwachten gebaseerd op onze voorlopige gegevens uit het muis-tot-muis enten, we dat MIME doeltreffend zullen voor het bereiken van donor-cel-gemedieerde myogenesis van menselijk donorweefsel voor dode foetussen, zo lang als donor SCs levensvatbaar zijn. Tot slot, met extra testen en valideren hopen we dat de MIME-techniek ontwikkelen van nieuwe therapieën helpen zal om donor-cel-gemedieerde myogenesis bij mensen met ziekten van de spier.
Het succes van de MIME-techniek is kritisch afhankelijk van het donorweefsel binnen de fasciaal compartiment (epimysium) van de host-spier juist te embedding. Alleen als de donorweefsel wordt geplaatst binnen de gastheer spier compartiment, zullen het kunnen bieden van SCs aan de host spier op een nauwkeurige wijze. Als de donorweefsel wordt geplaatst buiten de gastheer spier, is het onduidelijk wat haar lot zou zijn. In onze experimenteel model voor MIME-gebruiken we de TA spier als de host-spier, aangezien het prominente en oppervlakkig geplaatst in het anterolateral aspect van het been. De grootte, de afdrukstand en de anatomische positie van de TA spier, maakt het gemakkelijk om te bevestigen dat de donorweefsel correct wordt geplaatst binnen de gastheer TA spier na MIME. In dit document, hebben wij experimenteel bewijs verstrekt dat de donorweefsel relichtnet ingebed binnen de host TA spier op 3 dagen na MIME-, en dat er is donor-cel-gemedieerde myogenesis in de spier van de gastheer op 14 dagen na MIME.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd mogelijk gemaakt door een subsidie van de piloot van het Bondgenootschap voor regeneratieve revalidatie onderzoek en opleiding (AR3van T) en een faculteit Startup-pakket van de Wayne State University aan JAR. AR3T wordt ondersteund door de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en menselijke ontwikkeling (NICHD), National Institute of Neurological Disorders en Stroke (NINDS), en nationale Instituut van biomedische beeldvormings- en Bioengineering (NIBIB ) van het National Institutes of Health onder nummer P2CHD086843 Award. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |