Studi struttura-funzione nel topo cellule staminali embrionali Uso ricombinasi mediata Cassette Scambio

Si stima che i genomi dei mammiferi contengono circa 20.000 geni codificanti proteine. Lo splicing alternativo e modificazioni post-aumentare ulteriormente il repertorio di proteine. Proteine hanno una struttura modulare ¹ e spesso contengono più domini di interazione, che permettono la loro assunzione in diversi complessi proteici e la loro partecipazione molteplici processi cellulari ^2. Un esempio è la proteina multi-funzionale chiamato p120ctn. p120ctn è codificata dal gene Ctnnd1 e consiste in una grande dominio centrale armadillo ripetizione affiancato da un N-terminale ed una regione C-terminale. Il dominio di armadillo p120ctn lega ad un dominio juxtamembrana altamente conservata caderine classiche, che sono coinvolti nella adesione cellula-cellula, ma si lega anche al repressore trascrizionale Kaiso. Il dominio N-terminale di p120ctn interagisce con diverse chinasi, fosfatasi, piccoli RhoGTPases e associata ai microtubuli proteins ^3. È interessante notare che, a seguito di splicing alternativo, isoforme p120ctn possono essere generati da quattro codoni di inizio alternativi ^4. p120ctn isoforma 1A è la più lunga, come viene tradotto da più-5' codone di inizio e contiene il segmento N-terminale full-length. In p120ctn isoforme 3 e 4, questo segmento N-terminale è soppresso parzialmente e completamente, rispettivamente. Comprendere il ruolo preciso delle proteine ​​(o isoforme della proteina) ed i loro domini in diverse funzioni cellulari rimane una sfida.

Gene targeting in mESCs consente lo studio della funzione di una proteina attraverso la delezione genetica del gene corrispondente ed ha ampiamente contribuito alla identificazione di evolutivamente importanti e malattie rilevanti geni e vie. Questo importante passo avanti nel campo della genetica inversa è il risultato di progressi nel campo di isolamento Mesc e gene targeting grazie alla ricombinazione omologa ⁵ </sup>. ricombinazione omologa è un processo in cui vengono scambiati frammenti di DNA tra due porzioni nucleici simili o identici dopo doppio stranded (ds) DNA si rompe. Normalmente, HR è inefficiente perché pause dsDNA sono frequenti. Recentemente, l'efficienza del gene omologia-diretto mira potrebbe essere aumentato utilizzando nucleasi site-specific ^{6, 7,} ma purtroppo, questi sono inclini a effetti fuori bersaglio ^8. Una tecnica più affidabile per abilitare gene targeting è RMCE, che si basa su sistemi di ricombinazione sito-specifica, come Cre / loxP o FLPE / Frt. LoxP e sequenza Frt si trovano in P1 batteriofago e Saccharomyces cerevisiae, rispettivamente, e consistono di 34 bp, compresa una sequenza bp asimmetrica 8 che determina l'orientamento del sito. D'altra parte, l'orientamento, ad esempio, due siti loxP all'interno di un tratto di DNA a stabilire se il DNA floxed viene escisso o inversed upon ricombinazione mediata da Cre ^9. Inoltre, Cre può anche indurre una traslocazione se due siti si trovano su cromosomi diversi. RMCE sfrutta siti di ricombinazione heterospecific che non cross-reagiscono e che sono incorporati in un locus genomico. In presenza di un plasmide donatore che contiene un frammento di DNA fiancheggiata da siti stessi heterospecific, la ricombinasi inserirà questo frammento di DNA nel locus genomico RMCE compatibile causa della traslocazione doppio simultaneo (Figura 1). Qui, cloni correttamente solo RMCE targeting possono rendere farmacoresistenza grazie ad un promotore sul vettore entrante che restituisce una "trappola" promotore-minore resistenza neomicina gene (Neo ^R) presenti nel genoma R26 delle cellule di aggancio (figura 1) ^{10, 11.} Questo si traduce in un rendimento di targeting molto alta, spesso vicino al 100% ^{11, <}/ sup> ^12. In conclusione, il targeting RMCE-based è molto efficace e può essere utilizzato per studi struttura-funzioni; tuttavia, richiede un locus genomico pre-ingegnerizzato.

Figura 1. Schema del Targeting RMCE-mediata. RMCE permette lo scambio di segmenti di DNA da un vettore targeting in ingresso a un locus genomico definito se entrambi nutrono due siti FRT heterospecific (rappresentate da triangoli bianchi e rossi). Inoltre, il locus genomico ingegnerizzato contiene un promoterless e gene troncato resistenza alla neomicina (Neo ^R). Fornendo un promotore e codone di inizio nel frammento di DNA in entrata, eventi di ricombinazione solo corretti restauro resistenza neomicina, con conseguente elevate efficienze di targeting. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di tla sua figura.

ingegneria del genoma in mESCs consente la generazione di topi RMCE-compatibili. Nel 1981, due gruppi sono riusciti a catturare cellule pluripotenti dalla massa cellulare interna (ICM) di blastocisti e mantenendoli in coltura ^{13, 14.} mESCs sono in grado di auto-rinnovamento e la differenziazione in tutti i tipi di cellule embrionali e adulte, tra cui il lignaggio cellule germinali. Pertanto, gene targeting in mESCs consente studi reverse-genetici attraverso lo sviluppo di topi costitutivi o condizionali (utilizzando il sistema / LoxP Cre) KO. Tuttavia, il modo classico per isolare cellule di topo ES è molto inefficiente. Diversi importanti miglioramenti hanno notevolmente aumentato il tasso di successo per derivare linee Mesc, compreso l'uso di un siero sostituzione definito (SR) medium ^15, alternando mezzo Mesc contenente siero bovino fetale e SR (FBS) ^16, e l'uso di farmacocomposti logici quali pluripotin o 2i ^17. Pluripotin, una piccola molecola sintetica, consente la propagazione di mESCs in uno stato indifferenziato in assenza del fattore inibitorio della leucemia (LIF) e fibroblasti embrionali di topo (MEF) ^18. Infine, è stato dimostrato che mESCs possono essere isolati con un'efficienza molto elevata (vicina al 100%) quando un / FBS protocollo mezzo alternanza SR è combinato con LIF e pluripotin ^{19, 20.} Questi protocolli consentono l'isolamento efficace di mESCs KO RMCE compatibili che possono successivamente essere utilizzati per studi struttura-funzione.

Questo documento descrive un metodo che permette di identificare i settori chiave o residui all'interno di una proteina che sono responsabili per i processi cellulari specifici. A tal fine, una pipeline di tecnologie avanzate che permettono l'isolamento efficiente Mesc, mira assemblaggio vettoriale, e Mesc il targeting è stato creared. Come tali, i grandi pannelli con isoforme della proteina, i mutanti di dominio e effettori a valle possono essere introdotti in mESCs KO e possono essere valutati per la loro capacità di salvare la vitro KO fenotipo in.