في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

وقد ساهم القدرة على تصور العمليات التنموية الهامة في الفقاريات في الجسم الحي لجعل الزرد نموذجا أساسيا لدراسة الظروف العادية والمرض (إعادة النظر في ^{1 و 2).} على وجه الخصوص، الشبكية العصبية هي جزء لا يمكن الوصول إليها من الجهاز العصبي المركزي. شبكية العين يفسح المجال لسهولة إجراء دراسات من الخلايا العصبية بسبب، بعد بنية بسيطة نسبيا درجة عالية من التنظيم لها، وأنواع الخلايا العصبية الحفظ جدا في جميع أنحاء نوعا من الفقاريات ^3. يمكن اتباعها ديناميات السلوكيات الخلوية مثل انتشار الأسلحة النووية، خروج دورة الخلية، انقسام الخلايا غير المتماثلة، مواصفات مصير، والتمايز، وتشكيل الدوائر العصبية في جميع أنحاء العملية برمتها من retinogenesis، التي أنجزت في الشبكية المركزية للالزرد بنسبة 3 د postfertilization ( DPF) ^{4، 5،}المرجع "> 6 ^{و 7.}

وعلاوة على ذلك، فإن المتطلبات الوظيفية من الجينات المختلفة في كل مرحلة من المراحل المذكورة أعلاه يمكن تقييم متزامنة في شبكية العين الزرد، وتوفير ميزة على نماذج الفقاريات الأخرى التي الظواهر الناتجة عن تطبيق تقنيات خروج المغلوب الجينات يمكن تقييمها إلا بعد تشريح الجثة الثابتة الأنسجة. على وجه الخصوص، واستخدام خطوط المعدلة وراثيا التي يمكننا تصور ورصد التعبير من البروتينات الفلورية كما الجينات المحورة مراسل في شبكية العين، ويسمح لنا للحصول على قرار الزمني في التعبير الجيني الذي يكمن وراء نشأة معين نوع من الخلايا العصبية. نظرا للتطور السريع في الزرد، ويمكن تصور هذه الأحداث خلال الفترة التنموية برمتها، وبالتالي توفير رؤية أعمق في أهمية الزمانية في التعبير الجيني فيما يتعلق اكتساب هوية الخلايا العصبية وسلوك الخلية.

وأخيرا، هذه الأساليب يمكن الجمع بين الكفاءة في الزرد مع جيل من الوهم عن طريق زرع، مما أدى إلى نظرة ثاقبة جانبين رئيسيين من وظيفة الجين. أولا، ودراسة الخلايا المزروعة من جنين المانحة، الذي كان يطرق على جين معين أسفل في حين أنها تتطور في بيئة نوع البرية غير المسماة، ويسمح لنا للحصول على المعلومات ذات الصلة حول وظيفة الجين بطريقة خلية مستقلة. وهذا يؤدي إلى معلومات هامة عن وظيفة العوامل مصير المحدد الشبكية داخل الخلايا الاولية يعبر عنها عادة. وهذا ما يتضح من فحص نتائج مصير التنموية من الأسلاف التي لم تعد قادرة على توليد البروتين وظيفية من هذه الجينات ^{4، 6، 8، 9.} باستخدام هذا النهج، ونحن قد أظهرت أن العوامل المحددة العديد من مصير (على سبيل المثال، Vsx1، Atoh7، Ptf1a، Barhl2) تعمل خلية-autonomously لدفع مصير الخلايا العصبية للشبكية محددة؛ عدم التعبير الجيني يؤدي في المقام الأول إلى تبديل القدر، بحيث الخلايا مع الجينات ضربة قاضية لا تزال قابلة للحياة من خلال تبني خلية مصير بديل ^{4، 6، 7، 10.} ثانيا، مثل هذه التجارب خيالية يمكن استخدامها لتقييم مدى البرية تتصرف نوع الأسلاف عندما تعمل على تطوير ضمن بيئات وراثية مختلفة. على سبيل المثال، عن طريق مقارنة تطوير خلايا WT التي عادة ما تعبر عن الجين (والتحوير مراسل) في WT مقابل البيئة المضيفة التلاعب (على سبيل المثال، بالضربة القاضية جين / ضربة قاضية)، والآثار الناجمة على التعبير الجيني ومصير خلية يمكن تقييم . عدم وجود أنواع معينة من الخلايا العصبية في بيئة المضيف، على سبيل المثال، فقد تبين للتأثير على سلوك السلف النوع البري في خلية بطريقة غير المتمتعة بالحكم الذاتي، إلى التحيز لهم نحو التفريق في س ممثلة تمثيلا ناقصاص المفقودين أنواع الخلايا العصبية ^{4، 7، 11، 12.} وبالنظر إلى أن الخلايا العصبية للشبكية ولدت في ترتيب histogenic يصونها بالتتابع التعبير توقيت الجينات مصير المحدد العصبية محددة (التعبير الجيني مصير) (إعادة النظر في ^13)، استخدمنا هذه الطرق لشرح كيفية وتوقيت التعبير مصير الجيني في الأسلاف نوع البرية يتأثر عندما تتطور هذه الأسلاف في البيئات الشبكية المضيفة مع التراكيب الخلوية الشاذة التي يسببها. هنا، ونحن الخطوط العريضة لهذه النهج كدليل لكيفية الجمع بين تقنيات قياسية نسبيا، وتستخدم على نطاق واسع يمكن النظر في توقيت التعبير الجيني مصير في تطوير الأسلاف شبكية العين ^{8 و 9.}

يصف هذا البروتوكول نهج تجريبي يجمع الوقت الفاصل بين التصوير مع سهولة فيتشكيل زرع في الجسم الحي السابقين تطوير الجنين الزرد لمتابعة mosaically الفردية الخلايا المسمى طوال فترة من retinogenesis التنموية. عن طريق أداء التلاعب الجيني وظيفية سواء في الجنين المضيف، الجنين المانحة، على حد سواء أو لا، يمكن للمرء أن تقييم الحكم الذاتي خلية من وظيفة الجين. ويمكن تكييف هذا النهج على نطاق واسع على أسئلة بحوث مماثلة في أي نظام آخر والتي المكونات الفردية المذكورة هنا هي مناسبة.