Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.
The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.
Böyle mikrosefali gibi İnsan nörogelişimsel bozukluklar, sadece kötü nedeniyle insan beyni uzun bir kortikal yüzeye, insan olmayan hayvanlardan farklı benzersiz bir özelliğe sahip olması nedeniyle hayvan modellerinde incelenebilir.
Bu özellik, insan beyin gelişimi yeterli in vitro hücre kültürü sisteminde, bir 2D incelenecek bir karmaşık işlemi yapar. Gelişmekte olan 3D kültür teknikleri uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) doku benzeri organoids üretilmesini sağlar. 3B süspansiyon kültüründe pluripotent kök hücrelerinin in vitro farklılaşma organize, tabakalı doku, 1, 2, 3 sebebiyet veren, zamanında ve bölgeye özgü bir şekilde, çeşitli hücre tiplerinin oluşmasını sağlar. 3D kültür teknolojilerini öncülük ve kök hücrelerinden başlayarak, organ oluşumu karmaşıklığını demystified laboratuarlar sayesindeinsan beyin gelişimi erken olayları tanımlamak için ve di vitro, 1, 2, 3 mikrosefali model beyin organoids üreten güçlü bir yöntem geliştirdi. Biz Lancaster ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntem adapte olması dikkat çekicidir. serebral organoids 1 oluşturmak için. Bu yöntem deneysel gereksinimlerine göre değiştirildi.
Gabriel ve diğerleri arasından bir çalışmanın amacı. beyin gelişimi sırasında nöral kök hücre bakımı hücresel ve moleküler mekanizmaların analiz etmektir. Bunu yapmak için, mekanik bir çalışma mikrosefali hasta 4 türetilen 3D beyin organoids nöral projenitör hücreler (NPC) analiz ederek gerçekleştirildi. Bu hasta CPAP, sentrozom biogenezinin 5 için gerekli olan korunmuş centrosomal proteininde bir mutasyonun taşıdı. Bir yaygın olarak kabul hipoTez mikrosefali NPC havuz tükenmesi sonucu olduğunu ve bu, hücre ölümüne veya erken farklılaşma 1, 6, 7, 8, 9 ya da bağlı olabilir.
Mikrosefali beyin organoids ventriküler dilimleri (VZS) analiz ederek, bu NPC önemli sayıda sağlıklı bir vericiden 4 türetilmiş beyin organoids farklı olarak, asimetrik hücre bölünmesinin olmadığı gösterilmiştir. Mikrosefalik beyin organoids kapsamlı mikroskopik ve biyokimyasal analizler zamanında kirpikler sökme 4 CPAP için beklenmeyen bir rol ortaya çıkardı. Spesifik olarak, mutasyona uğramış CPAP NPC 4 erken farklılaşmasına yol açan, gecikmeli kirpik sökme ve gecikmeli hücre döngüsü yeniden giriş ile bağlantılıdır. Bu sonuçlar mikrosefali ve th cilia bir rol oynadığını düşündürmektedirnörogenez ve beyin büyüklüğü kontrol 10 sırasında EIR tutulumu.
Bu protokolün birinci parçası homojen beyin organoids oluşturmak için üç aşamalı bir yöntemi bir açıklamasıdır. Daha önce belirtildiği gibi, orijinal Lancaster protokol adapte ve amacımızı 1 uyacak şekilde değiştirildi. İlk olarak, insan iPSCs Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matris üzerinde tanımlı bir besleyici içermeyen durumda kültürlenir. Bu adım, besleyici bağımlı pluripotent kök hücre kültürlerinin varyasyonları önler. Bu protokol, sinir farklılaşmasının indüksiyonu, sinir epiteli iPSCs şirketinden başlar oluşturulur. embriyoit gövde (EB) oluşturma aşamasını, daha kontrollü ve yönlendirilmiş bir şekilde sinir farklılaşma ilerler atlanarak. Bu yaklaşım, mezoderm ve endoderm gibi germ hücre katmanları, spontan ve yönsüz oluşumunu kısıtlar. Bu protokolü uygulayarak, nöral rozetler içeren Neurospheres EH için 5. günde hasat edilebilirS matrisi gömme ve sabit süspansiyon kültürü. Protokolde üçüncü adımı için kullanılan Organoid ortam dorsomorphin ve SB431542 ile takviye edilir. Dorsomorphin kemik morfojenik protein (BMP), küçük moleküllü inhibitörüdür ve SB431542 TGF / aktivin / düğüm sinyal yolunu inhibe eder. Bu faktörler bir araya sinir farklılaşmasını daha etkili bir tek 11, 12, 13, 14-cis retinoik asit teşvik edebilir.
Hep birlikte, bu modifikasyonların organoids boyunca en az varyasyonları ile, beyin organoids tekrarlanabilir üretilmesini mümkün kılmak. Önemli olarak, bu yöntem sağlam sentrozom ve hücre döngüsü dinamiklerini etkileyen genlerinde mutasyon taşıyan hasta iPSCs gelen mikrosefalik beyin organoids oluşturmak için uygulanmıştır.
Bu protokolün ikinci bölümü br hazırlamak için talimatlar verirain analizi ve mikrosefali hücresel kusurların yorumlanması için organoids. Bu tespit, krio-bölümleme, immünofloresan boyama ve odaklı mikroskopik analiz içerir. Bu protokol beklenen sonuçların ayrıntılı bir açıklama ile ve yorumlanması için rehberlik okuyucu sağlayacaktır.
MCPH in vivo ya da insan hücre kültürü, in vitro olarak yaklaşımlar hayvan modellerinde değinmeyecek edilemez bir karmaşık insan nöro hastalıktır. MCPH klinik tezahürü erken nöron başladığında, ilk trimesterde görünmeye başlar. Böylece, 3D beyin organoids MCPH gelişimini modellemek için güvenilir deneysel sistemi temsil etmektedir. Buna ek olarak, 3D insan beyni organoids önemlisi, iii) çeşitli farklılaşma i) çeşitli genetik arka planı olan hasta numunelerinin spektrum…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Fritz Thyssen Vakfı (Az.10.14.2.152) tarafından desteklenmiştir. Biz doku gömme tesisi ve CMMC mikroskop çekirdek tesisine minnettarız. Biz Sentrozom ve Sitoiskelet Biyoloji Laboratuvarı üyeleri tarafından sunulan tartışmalar ve teknik destek için müteşekkiriz. Yazıları ve düzeltilmesi için Li Ming Gooi teşekkür ederim.
Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C |
Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
Spinner flask 250 ml | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers multiple suppliers |
TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |