Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler
Summary
Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.
Abstract
Plasenta embriyogenez sırasında geliştirmek için ilk organdır ve gelişmekte olan embriyonun yaşam için gereklidir. Plasenta preimplantasyon blastosist ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerinden ayırt çeşitli trofoblastik hücrelerin oluşur. Bu nedenle, insan plasenta erken farklılaşma olayları anlayışımız nedeniyle insan embriyogenez izolasyon ve manipülasyon etik ve yasal kısıtlamaların sınırlıdır. Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) insani gelişmeyi araştırmak için sağlam bir model sistem ve aynı zamanda çeşitli trofoblastik hücre tiplerinin işaretleri ifade trofoblastik hücrelerin içine in vitro ayırt edilebilir. Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin / Düğüm sinyal yollarının inhibitörleri kullanan trofoblastik hücrelerin içine hPSCs ayırt etmek için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol, siRNA'lar ile transfekte edilebilir, çeşitli trofoblastik hücre tipleri oluştururkayıp-fonksiyon fenotipleri soruşturma veya patojenler ile enfekte olabilir için. Ayrıca, hPSCs genetiği değiştirilmiş olabilir ve daha sonra fonksiyon-kazanç analizleri için trofoblast atalarıdır ayrışmıştır. HPSCs başlayarak insan trofoblast üretmek için bu in vitro farklılaştırma yöntemi erken insan embriyosunun ile çalışma etik ve yasal kısıtlamalar üstesinden gelir ve bu sistem ilaç keşfi ve kök hücre araştırmaları da dahil olmak üzere, çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir.
Introduction
Plasenta gebelik sırasında fetusun büyüme ve hayatta kalmak için gerekli ve maternal ve fetal dolaşıma arasında gaz, besin, atık ürünleri ve hormonların alışverişini kolaylaştırır. Memeli Embriyogenez sırasında oluşan ilk organ 6-7 days insanlarda post-anlayışı ve fareler 1, 2, 3, 4 3,5-4,5 gün geliştirmeye başladı plasenta vardır. Trofoblastik hücreler plasenta en önemli hücrelerdir ve bu hücreler memeli embriyosunun ilk soy farklılaşma olaylardan biri temsil etmektedir. Onlar preimplantasyon blastosist dış ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerden kaynaklanır. plasenta gelişiminin erken aşamalarında bilgimiz erken insani gelişme modelleme etik ve lojistik kısıtlamalar ile sınırlıdır.
embriyonik implantasyon, trofoblastlar sırasındaanne epitel istila ve özel progenitör hücrelerin 5 farklılaşırlar. Sitotrofoblastlar (CTBS) sigorta ve sinsityotrofoblastlarda (SYNs) ve extravillous invaziv trofoblastlar (EVTs) içine ayırt, farklılaşmamış atalarıdır, tek çekirdekli hangi çapa rahim plasenta. SYNs, gebeliği sürdürme için gerekli hormonları sentezlemek terminal açıdan farklılaşmış hücreleri çok çekirdekli edilir. Trofoblastik hücrelerde bozukluklar düşük, pre-eklampsi ve intrauterin gelişme geriliği, 1 sonuçlanır olarak EVTs ve SYN isteklerini oluşturmak erken farklılaşma olayları, plasental oluşumu için gereklidir. Geliştirilen insan trofoblast hücre hatları tipleri CTBS ve plasental hormonlar ve ekran invaziv özellikleri 6 üretmek koryokarsi-, ölümsüzleşti içerir. İnsan ilk trimester plasenta primer trofoblastik hücreler izole ama hücreler hızla dif olabilirfarklılaştıran ve in vitro çoğalan dur. Önemlisi, dönüştürülmüş ve birincil hücre hatları tümörijenik ve ölümsüzleştirdi trofoblast hücre hatları doğru birincil trofoblast 7 temsil edemez belirten farklı gen ekspresyon profillerini var. Ayrıca, bu çizgiler üçüncü trimesterde üzerinden ilk sonra aşamalı türetilen çünkü plasental trofoblast kök hücre atalarıdır benzemeye olası değildir.
Plasenta oluşumu ve işlevi erken olayları incelemek için başlangıç aşamasında, insan trofoblast in vitro kültür sistemi içinde sağlam bir ihtiyaç vardır. preimplantasyon embriyo iç hücre kütlesi ile özelliklerini paylaşan İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC), sıklıkla erken plasenta oluşumu da dahil olmak üzere, erken insan gelişimi modellemek için kullanılır. Hem insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) ve HESC Kemik Mor kullanılarak in vitro trofoblast olarak ayırt edilebilirphogenic Proteinler 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. BMP4 kullanarak trofoblastik hücrelerin pluripotent hücrelerin Bu dönüşüm, insan hücreleri için özeldir ve erken insan embriyosunun 9, 16 erişimi gerektirmez, çünkü yaygın erken insan plasenta gelişimini incelemek için kullanılır. Son zamanlarda, keşfedildi inhibitörleri çok A83-01 (A) ve SMAD2 / 3 ve MEK1 / 2 sinyal yollarının bloke PD173074 (P), trofoektoderm benzeri progenitörleri, esas olarak Syns halinde hPSC farklılaşma verimini artırır ve mezoderm, endoderm, ya da ektoderm hücreleri 9, 17 kapsamlı nesil olmadan EVTs, </sus>. 12 gün, insan blastosist aşamasında embriyoların izole tropo-ektoderm hücrelerini benzer gen ekspresyon profillerine sahip ve çeşitli plasental spesifik büyüme hormonu salgılayan bu ortam şartları kullanılarak, HESC Bu in vitro model sistemi 9, 11 geçerliliğini destekleyen farklı. Burada, BMP4 / A / P kültür ortamı kullanılarak insan trofoblast progenitörlerde hPSCs in vitro farklılaşması için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu koşullar, lipofeksiyon aracılı transfeksiyon kullanılarak RNA sekanslama, gen bozulması siRNA'lar kullanılarak patojen enfeksiyonu ve genetik modifikasyonunu da içeren uygulamalarda, çok çeşitli hücrelerin, bol sayıları üretir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz trofoblast atalarıdır içine hESC ayırt etmek için temel adımları sundu. Bu protokol, en son trofoblastik hücrelerin farklılaşmasını arttırmak ve tipik haliyle, tek başına BMP4 tedavisi ile gözlenir mezoderm progenitörlerle üretilmesini önlemek hızla Aktivin / Düğüm sinyal inhibitörleri ilavesiyle hESC ayırt etmek için optimize edilmiştir. BMP4 model sistem insan trofoblast soy şartname ve genişleme erken aşamalarında incelenmesi için izin verir. Buna ek olarak, bu BMP4 modeli sistemi,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 um syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
Riferimenti
- Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?. Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
