Summary

Tonina Delfín (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolección, criopreservación y fecundación In Vitro heteróloga

Published: August 21, 2017
doi:

Summary

Aquí, presentamos los protocolos que se han utilizado con éxito para delfín espermatozoides recolección, criopreservación y rendimiento de fecundación in vitro heteróloga utilizando ovocitos bovinos.

Abstract

El uso de espermatozoides criopreservados delfín facilita el intercambio de material genético entre parques acuáticos y hace accesible a los laboratorios de estudios para mejorar nuestra comprensión de la reproducción de mamíferos marinos espermatozoides. Fecundación in vitro heteróloga, un reemplazo para la FIV homóloga, podría proporcionar un medio para probar la fertilidad de esperma potencial; para estudiar la fisiología de gametos y desarrollo temprano del embrión; y evitar el uso de ovocitos de valioso delfín, que son difíciles de obtener. Aquí, presentamos los protocolos que se han utilizado con éxito para recoger y criopreservar espermatozoides de delfín. La colección de semen se realiza por estimulación manual de delfines entrenados. Criopreservación se logra utilizando un extensor TRIS base de yema de huevo con el glicerol. Además, presentamos un protocolo que describe FIV heteróloga utilizando delfines espermatozoides y ovocitos bovinos y que verifica la naturaleza híbrida del embrión resultante mediante PCR. Fecundación heteróloga plantea preguntas sobre fertilización y puede utilizarse como una herramienta para estudiar la fisiología de gametos y desarrollo temprano del embrión. Además, el éxito de la FIV heteróloga demuestra el potencial de esta técnica para probar la capacidad, lo que vale la pena la examinación adicional de la fertilización de espermatozoides delfín.

Introduction

Tecnologías de reproducción asistida están poco desarrollados en los animales salvajes, incluyendo los mamíferos marinos. La falta de métodos sensibles para evaluar éxito fecundante de espermatozoides contribuye al lento desarrollo de tecnologías reproductivas en especies como los delfines. No fue hasta recientemente que los parámetros seminales básicos del delfín mular (Tursiops truncatus) fueron reportados1,2. Sin embargo, las variables tales como la motilidad y morfología, aunque ampliamente utilizado, dan información limitada sobre la eficiencia reproductiva. El mejor indicador de la calidad del esperma es la evaluación del potencial fecundante.

Recientemente, nuestro grupo utiliza un método para evaluar semen delfín potencial de la fertilización mediante la evaluación de formación pronuclear masculina o la formación de embriones híbridos después de la fecundación in vitro heteróloga con zona intacta ovocitos bovinos3. El uso de FIV heteróloga delfín bovino tiene ventajas importantes sobre fecundación in vitro homóloga, como supera la dificultad de obtener ovocitos de delfín y facilita el uso de bien probado en vitro sistemas de maduración de ovocitos bovinos. Para evitar la especificidad de especie, fecundación heteróloga se realiza generalmente en la ausencia de ZP. Aunque se permite para la evaluación de la capacidad de los espermatozoides con acrosoma reaccionado se fusionan con la membrana vitelina, deteriora la evaluación de otras características relacionadas con la fertilización. El procedimiento descrito utiliza ovocitos intactos de la zona y permite la evaluación de los siguientes parámetros: enlace zona de esperma y fijación, penetración, polyspermy, formación pronuclear y escote de embrión híbrido.

Aquí, presentamos varios protocolos de recogida de esperma, espermograma básico, congelación de espermatozoides, así como la evaluación de la funcionalidad del esperma de delfines mediante la evaluación de la formación de embrión pronuclear o híbrido macho después de la fecundación in vitro heteróloga con zona intacta ovocitos bovinos.

Protocol

declaración de ética: todos los procedimientos experimentales fueron revisados y aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, aprobado por la sociedad para el estudio de la reproducción y a la ley de Bienestar Animal para el cuidado de mamíferos marinos. 1. Delfín colección de…

Representative Results

Los resultados, tablas y figuras (1 y 2) presentadas fueron reproducidas con permiso3. Espermatozoides de delfines tienen alta motilidad después de la congelación y descongelación Los eyaculados de delfín congelado porcentajes (% ± SD) de 84,5 ± 5.3 total motile y 69,1 ± 5.1 espermatozoides móviles progresivos. En términos de movilidad, es…

Discussion

Para muchas especies mamíferas diferentes, hay diversas ventajas al uso de semen congelado. Estos incluyen la capacidad de transferir material genético valioso, el potencial de distribución en todo el mundo, el bajo riesgo de contaminación y la capacidad de preservar gametos masculinos durante décadas. El uso de espermatozoides criopreservados es esencial para el delfín mular, porque esta especie está protegida en el Apéndice II de CITES, que limita el transporte y el intercambio de animales entre diferentes parq…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

su trabajo fue financiado por el Ministerio de economía y competitividad (70140-AGL2015-R a D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan y J. F. Pérez-Gutiérrez y la Fundación Séneca de Murcia (Grant 20040/germen/16 a F. García Vázquez)

Materials

FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

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