Una Guía Visual de Ordenación de Registros electrofisiológicos El uso de 'SpikeSorter'

Cualquier persona que graba señales extracelulares del cerebro usando métodos más sofisticados que un simple umbral de ventanas y en línea se enfrenta a la tarea de identificar y separar las señales de diferentes neuronas a partir de las señales de tensión ruidosos registrados por el electrodo. Esta tarea se conoce comúnmente como la clasificación pico. La dificultad de clasificación pico se complica por varios factores. Las neuronas pueden ser muy próximos entre sí de manera que las señales registradas de ellos por un electrodo cercano es probable que sean similares y difíciles de distinguir. Las señales producidas por una sola neurona puede variar con el tiempo, tal vez debido a los movimientos del electrodo, la cinética de los canales de sodio variable durante los periodos de alta velocidad de disparo, grados variables de activación de las conductancias de tensión en las dendritas que se acercan del electrodo, o posiblemente como resultado de los cambios en el estado de cerebro. Estos problemas pueden ser mitigados mediante el uso de múltiples arrays de electrodos (MEA) con muchos poco espaciados – r (20 100 micras) rabación canales que permite una mejor definición espacial de las señales de las neuronas individuales ya que normalmente se extienden por varios canales ^{1, 2.} Sin embargo, esto, combinado con el hecho de que las señales de las neuronas se extienden a lo largo de toda la longitud de la superposición de electrodo en el espacio, resulta en una potencialmente muy alta espacio tridimensional en el que los clústeres que corresponde a las neuronas únicas necesita ser identificado. Este problema se hace computacionalmente intratable durante más de un pequeño número de canales de electrodos. Hasta la fecha, no existe un acuerdo general-upon mejor método para la clasificación de pico, aunque muchas soluciones se han propuesto ^{3, 4, 5, 6, 7, 8} y grabaciones de los AAM se están convirtiendo cada vez más común ^9,culo = "xref"> 10. Debido a la clasificación pico no es un fin en sí mismo, sino que es simplemente un paso previo necesario antes de un nuevo análisis de datos, existe una necesidad de un paquete de fácil utilización que leerá en los archivos de datos de registro bruto y convertirlos en espiga trenes ordenados con un mínimo de usuario de entrada, y como forma rápida y fiable, como sea posible.

Este documento proporciona un tutorial para el uso de SpikeSorter – un programa desarrollado con el objetivo de satisfacer esas necesidades. El programa se basa en algoritmos descritos en los documentos publicados previamente ^{11, 12, 13.} Los objetivos en el diseño del programa fueron que a) debe tener una interfaz fácil de usar que requiere poco o ningún conocimiento previo de programación informática o de pico de clasificación metodología; b) deben ser necesarios pocos o ningún otros componentes de software especializado más allá de los sistemas operativos estándar de Windows o Linux; do </em>) Una amplia gama de formatos de grabación de datos para la importación y exportación de datos debe ser apoyada; d) la necesidad de que la entrada del usuario durante la clasificación debe reducirse al mínimo, y e) clasificar los tiempos deben escalar de una manera razonable, a ser posible de forma lineal, con la duración de la grabación y el número de canales en el electrodo. Los algoritmos implementados en el programa incluyen: a) un conjunto flexible de estrategias de pre-procesamiento y detección de eventos; b) una división automatizada y estrategia de conquista de reducción de la dimensión que agrupa las formas de onda de voltaje en base a los componentes principales (PC) de distribución obtenidos a partir de subconjuntos de canales asignados a grupos específicos; c) automatizado agrupación de distribuciones de PC con un procedimiento rápido agrupamiento basado en el algoritmo de media de desplazamiento de ^{3, 14,} y d) fusión de pares parcialmente automatizado y la división de los grupos para asegurarse de que cada uno es tan claro como sea posible de todos los demás. para This, un conjunto de procedimientos se ha agregado que permiten la división manual o fusión de clusters basados ​​en la inspección de las distribuciones de PC, cruzada y auto-correlograms de espiga trenes y parcelas en tiempo de amplitud de formas de onda de pico. Las grabaciones de tetrodos, matrices, arrays tetrodo Utah, así como los AMA unifamiliares y multifamiliares de espiga pueden ser leídos y ordenadas. El límite de corriente en el número de canales es 256 pero esto puede aumentar en el futuro.

Otra aplicación de código abierto multiplataforma, "spyke" (http://spyke.github.io), también está disponible. Escrito por uno de nosotros (MS) en Python y Cython, spyke utiliza el mismo enfoque general como SpikeSorter, con algunas diferencias: para reducir la demanda de memoria, los datos en bruto se carga en pequeños bloques, y sólo cuando sea absolutamente necesario; grupos se muestran en exclusiva, manipulados, y se clasifican en 3D; y de componentes principales y análisis de componentes independientes son utilizados como métodos de reducción de dimensiones complementarias. Spyke requiere más usuario eninteracción, sino que se basa en gran medida en el teclado y el ratón atajos y una cola de deshacer / rehacer para explorar rápidamente los efectos de diversos factores en la agrupación de cualquier subconjunto dado de espigas. Estos factores incluyen el canal de espiga y la selección del rango de tiempo, la alineación pico, las dimensiones de agrupamiento y ancho de banda espacial (Sigma) ^11.

La siguiente es una breve descripción de los algoritmos y estrategias utilizadas para la clasificación. Más descripciones completas se pueden encontrar en las publicaciones anteriores ^{11, 12, 13} y en las anotaciones que se puede acceder a través de los botones de ayuda (identificados con un '?') Dentro de SpikeSorter. Después de cargar un archivo de voltaje extracelular prima y el filtrado de los componentes de baja frecuencia, una etapa inicial de los resultados de detección de eventos en un conjunto de eventos, cada uno de los cuales consta de un breve panorama de tensión antes y después de la hora del evento. Si los elegidosmontó sitios están suficientemente espaciadas estrechamente (<100 micras), las señales de una sola unidad aparecerá generalmente en varios canales vecinos. Un canal central se elige de forma automática para cada evento, correspondiente al canal en el que el voltaje de pico a pico del evento es más grande. Automatizados de clasificación se inicia mediante la formación de un solo grupo inicial para cada canal del electrodo, que consiste en todos los eventos que fueron localizados a ese canal. Una unidad situada a medio camino entre canales puede dar lugar a picos que se localizan (quizás al azar) a diferentes canales: los racimos de estos dos conjuntos de picos se identificaron como similar y se fusionaron en una etapa posterior. A continuación se calcula la forma de onda promedio de los eventos en cada grupo inicial. Esto se conoce como la plantilla clúster. canales auxiliares son asignados a cada grupo en función de las amplitudes y desviación estándar de las formas de onda de la plantilla en cada canal. valores de los componentes principales A continuación se calculan para cada clúster basado en On las formas de onda en el conjunto de canales asignado. El usuario puede elegir el número de las principales dimensiones de los componentes de empleo: por lo general 2 es suficiente. Cada grupo se divide entonces en una nueva serie de grupos, y esto se repite hasta que ninguno puede ser aún más dividida por la agrupación automatizada.

En este punto, un conjunto inicial de, digamos, 64 racimos de un electrodo de 64 canales, se pueden dividir en dos o tres veces ese número, dependiendo del número de unidades que estaban presentes en la grabación. Pero debido a la asignación de variables de los acontecimientos de las unidades individuales a diferentes canales, el número de grupos que se encuentra en esta etapa es casi con toda seguridad más grande de lo que debería ser. La siguiente etapa de clasificación es para corregir el oversplitting mediante la comparación de pares de racimos y la fusión de pares similares o reasignación de eventos de uno a otro. Esta etapa de clasificación se denomina "unir y separar '.

La fusión y división

Para n grupos, hay N * (N-1) / 2 pares y por lo tanto el número de pares crece como N ^2, que es indeseable. Sin embargo, muchas parejas pueden ser excluidos de la comparación debido a que los dos miembros de la pareja están físicamente separados. Esto reduce la dependencia a algo que está más linealmente relacionada con el número de canales. A pesar de este acceso directo, la fusión y la etapa de división todavía puede ser bastante tiempo. Funciona de la siguiente manera. Cada par de clúster que se va a comparar (los que están físicamente próximos entre sí, como se juzga por la superposición de los conjuntos de canales asignados a cada uno) temporalmente se fusiona, a pesar de mantener las identidades de los picos en los dos grupos de miembros conocidos. Los principales componentes del par resultante de la fusión se calculan entonces. Una medida de la superposición entre los puntos en los dos grupos se calcula basándose en la distribución de los dos primeros componentes principales.

La forma en que el ov medida ERLAP se calcula se describe con más detalle en otra parte ^11. Su valor es cero si los clústeres no se superponen en absoluto, es decir, el vecino más próximo de cada punto está en el mismo grupo. Su valor es de cerca de 1 si los grupos se superponen completamente, es decir, la probabilidad de que el vecino más cercano está en el mismo grupo es el mismo que el predicho a partir de una mezcla uniforme de puntos.

Varios se toman las decisiones que adoptan la medida de solapamiento en cuenta. Si el solapamiento es mayor que un cierto valor, los grupos se pueden combinar. Si el solapamiento es muy pequeño, el par de clúster puede ser definida como distinta y dejó solo. Los valores intermedios, lo que indica una separación incompleta de la pareja de clúster, puede ser señal de que la pareja debe fundirse y volver a dividir, el resultado deseado ser un par de racimos con menos solapamiento. Estos procedimientos se ejecutan primero en una etapa automatizada y luego en una etapa de guiado manualmente.

tienda "> En la etapa automatizado, pares de racimo con un alto valor de solapamiento se fusionan;. luego pares de racimo con el intermedio a valores bajos de solapamiento se fusionan y re-split En la segunda etapa, guiada por el usuario, el usuario se presenta con toda la restante pares de racimo ambiguos (es decir, aquellos con valores de solapamiento en un rango intermedio definido) en secuencia y se le pide que elija si a) para fusionar el par, b) se funden y resplit el par, c) declarar el par a ser distinto (que anulará la importancia de la medida de solapamiento), o d) para definir la relación entre la pareja como "ambigua" que indica que los picos en el par es poco probable que estar bien ordenados. se proporcionan varias herramientas para ayudar con estas decisiones, incluyendo auto – y transversales correlograms y diagramas de series de tiempo de la altura de pico y los valores de PC.

Lo ideal sería que, al final de las etapas de la fusión y división, cada grupo debe ser distinto de todos los demás,ya sea porque tiene pocos o ningún canales en común con otros grupos, o porque el índice de superposición es menor que un valor definido. Este valor es seleccionable por el usuario, pero es típicamente 0,1. Clusters (unidades) que pasan esta prueba se definen como "estable", los que no (porque la superposición con uno o más de otros grupos es mayor que el umbral) se definen como "inestable". En la práctica, la gran mayoría de las unidades terminan siendo definido como "estable" en el acabado de la clasificación, dejando el resto para cualquiera ser descartado o tratado como potencialmente multi-unidad.

Requisitos de Software

SpikeSorter es compatible con versiones de 64 bits de Windows 7 y Windows 10, y también se ha ejecutado con éxito bajo Linux usando el emulador de vino. Los archivos de datos se cargan por completo en la memoria (para velocidad), por lo tanto necesita RAM disponible a escala con el tamaño de la grabación (permitir que alrededor de 2 GB para el programa en sí). electrofisiológicoAL archivos de datos de más de 130 GB de tamaño han sido ordenados con éxito tanto en entornos Windows y Linux. Las opciones se accede a través de los menús estándar de Windows, una barra de herramientas y cuadros de diálogo. La disposición de los elementos en el menú coincide más o menos el orden de las operaciones de clasificación, comenzando con el menú "Archivo" de la izquierda para la entrada de datos y el menú "Exportar" a la derecha que permite la exportación de datos ordenados. botones de la barra proporcionan accesos directos a los usados ​​comúnmente elementos de menú.

El archivo de configuración de canales

Muchos formatos de grabación de datos no almacenan ubicaciones de canal. Sin embargo, a sabiendas de éstos es esencial para la clasificación pico. Los canales también pueden ser numerados de diversas maneras por software de adquisición: SpikeSorter requiere que los canales se numeran en secuencia, comenzando con el canal 1. Por lo tanto, un archivo de configuración de electrodo auxiliar tiene que ser creado que se puede volver a asignar los números de canal para seguir la regla secuencial, y para loc canal de tiendasciones. El archivo de configuración de canal es un archivo de texto con una sola fila de texto para cada canal. La primera línea del archivo almacena un nombre de texto de hasta 16 caracteres de longitud, que identifica el electrodo. Los números en las líneas subsiguientes pueden ser separados por pestañas, una coma o espacios. Hay cuatro números en cada fila proporcionar (en orden): el número de canal en el archivo, el número de canal a la que ha de ser asignada (es decir, el número que se utilizará por SpikeSorter), y las coordenadas X e Y de la canal, en micras. La coordenada x normalmente se toma como perpendicular a la dirección de inserción del electrodo y la coordenada y en consecuencia sería profundidad en el tejido. El archivo de configuración tiene que ser colocado en el mismo directorio que el archivo de grabación. Hay una cierta flexibilidad en la forma en que puede ser nombrado. El programa buscará primero un archivo que tiene el mismo nombre que el archivo de datos en bruto, pero con una extensión .cfg. Si ese archivo is no se encuentra, se buscará el 'electrode.cfg' archivo. Si no se encuentra el archivo que a su vez se genera un mensaje de error para indicar una falta de información sobre la disposición de canales.