No invasiva<em> En Vivo</emHome Idiomas Ingresar a Epistemonikos Búsqueda avanzada Fluorescencia de imágenes ópticas de la actividad MMP inflamatoria utilizando un agente de imagen fluorescente activable
Summary
Este documento explica la aplicación de imagen fluorescente utilizando una sonda de formación de imágenes óptico activable para visualizar la actividad in vivo de las metaloproteinasas de matriz de teclas en dos modelos experimentales diferentes de inflamación.
Abstract
Este documento describe un método no invasivo para metaloproteinasas de la matriz de formación de imágenes (MMP) -Actividad por una sonda fluorescente activable, a través de fluorescencia in vivo de imágenes ópticas (OI), en dos modelos diferentes de ratón de inflamación: a la artritis reumatoide (RA) y un contacto reacción de hipersensibilidad (CHR) modelo. La luz con una longitud de onda en la ventana de infrarrojo cercano (NIR) (650 – 950 nm) permite una penetración más profunda del tejido y la absorción de la señal mínima en comparación con las longitudes de onda por debajo de 650 nm. Las principales ventajas utilizando fluorescencia OI es que es barato, rápido y fácil de implementar en diferentes modelos animales.
sondas fluorescentes activables son ópticamente silenciosa en sus estados inactivados, pero se convierten en altamente fluorescente cuando es activado por una proteasa. MMP activadas conducen a la destrucción de tejidos y juegan un papel importante para la progresión de la enfermedad en las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (DTHRs) como la AR y CHR. Además, las MMPs sonLas proteasas clave para el cartílago y la degradación ósea y son inducidas por macrófagos, fibroblastos y condrocitos en respuesta a citoquinas pro-inflamatorias. Aquí se utiliza una sonda que se activa por la clave MMPs como MMP-2, -3, -9 y -13 y describir un protocolo de imagen para la fluorescencia infrarroja cercana OI de MMP actividad en la AR y el control de ratones 6 días después de la inducción de la enfermedad, así Como en ratones con reuma aguda (1x desafío) y crónica (5x desafío) en el oído derecho en comparación con oídos sanos.
Introduction
Las enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide (RA) o psoriasis vulgar se clasifican como de tipo retardado reacciones de hipersensibilidad (DTHRs). 1 RA es una enfermedad autoinmune común caracterizada por sinovitis erosiva y destrucción de las articulaciones. 2 articulaciones artríticas inflamadas demuestran la infiltración y proliferación de células inflamatorias, un aumento de la expresión de las células pro-inflamatorias que conducen a la formación de pannus, cartílago y destrucciones óseas. 3, 4 La escisión de moléculas de matriz extracelular, como el colágeno por metaloproteinasas de la matriz (MMPs), es esencial para la conversión de tejido y la angiogénesis y causa destrucciones tisulares. 5, 6 de contacto reacciones de hipersensibilidad (CHR) se caracterizan por la agregación de los neutrófilos que conduce a un estallido oxidativo. 7 De manera similar a la AR, las MMP en CHR son INVOLved en la conversión de tejido, la migración celular y la angiogénesis con el fin de establecer la inflamación crónica.
Para investigar RA, se utilizó la isomerasa de glucosa-6-fosfato (GPI) de inyección -suero modelo de ratón. 8 El suero de los ratones K / BxN transgénicas que contienen anticuerpos contra GPI, se inyectó en ratones BALB / c tratados previamente después de lo cual la inflamación reumática comenzó a desarrollar dentro de las 24 h con un máximo de la hinchazón del tobillo en el día 6 después de la inyección GPI-suero (véase 1.1). Para analizar CHR crónica, C57BL / 6 ratones fueron sensibilizados con trinitroclorobenceno (TNCB) en el abdomen. La oreja derecha fue desafiado hasta 5 veces empezando 1 semana después de la sensibilización (véase también 1.1 y 1.2).
No invasiva pequeña OI animal es una técnica basada en la investigación in vivo de fluorescent-, chemiluminescent- y bioluminiscentes señales, que se utilizan principalmente en la investigación preclínica. Los datos semi-cuantitativos adquirida da una visión de la Molecmecanismos Ular en los órganos y tejidos del saludables, así como modelos animales experimentales enfermas, y permite longitudinal seguimiento mediciones (por ejemplo, para evaluar los perfiles de respuesta terapéutica in vivo). Una gran ventaja de estudios longitudinales es la reducción del número de animales, como los mismos animales se pueden medir en los estudios de seguimiento en varios puntos de tiempo en lugar de utilizar diferentes ratones por punto de tiempo. La resolución de OI permite imágenes funcionales detalladas de los órganos y estructuras de tejido incluso más pequeños en animales de experimentación.
El uso de filtros de excitación y emisión específicos con un espectro de transmisión estrecha, una protección contra la luz dispersada por una prueba de luz "caja oscura" y un dispositivo de carga acoplada sensible (CCD), que se enfría en muchos dispositivos hasta -70 ° C , permite altamente específica y mediciones sensibles de señales de fluorescencia.
Mediante el uso de agentes fluorescentes con excitación-yLos espectros de emisión en la ventana de fluorescencia del infrarrojo cercano (650 – 950 nm), se pueden mejorar significativamente las relaciones señal / ruido. La ventana de fluorescencia del infrarrojo cercano se caracteriza por una absorción relativamente baja de la señal por la hemoglobina y el agua, así como por una baja fluorescencia de fondo. 9 Esto permite una profundidad de penetración de hasta 2 cm en el tejido de animales pequeños. Las sondas OI pueden dirigirse directamente a un objetivo ( por ejemplo, mediante un anticuerpo marcado con fluorescencia) o pueden activarse en el tejido diana ( por ejemplo, por proteasas). Las sondas OI activables son opticamente silenciosas en su forma inactivada debido a la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) a un resto de extinción, que transfiere la energía de excitación dentro de la molécula a otro dominio. Si el colorante es escindido (por una proteasa, por ejemplo) la energía ya no se transfiere dentro de la molécula y una señal fluorescente puede ser detectada por OI. Esto permite el diseño de sondas OI con alta especificidadY para distintos procesos biológicos y excelentes relaciones señal / ruido.
El siguiente protocolo explica en detalle la preparación de los animales, las mediciones de OI usando una sonda de OI Activable para visualizar la actividad de MMP-2, -3, -9 y -13 in vivo y dos modelos experimentales de inflamación (RA, CHR).
Protocol
Representative Results
Discussion
OI es una herramienta muy útil, rápida y barata para la imaginería molecular in vivo no invasiva en la investigación preclínica. Una fuerza particular de OI es la capacidad de monitorear procesos altamente dinámicos como respuestas inflamatorias. Por otra parte, OI permite que uno siga el curso de una enfermedad por un período extenso de tiempo, extendiéndose de días a las semanas.
OI tiene varias ventajas sobre otras modalidades de imagen in vivo,</em…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Daniel Bukala, Natalie Altmeyer y Funda Cay por su excelente soporte técnico. Agradecemos a Jonathan Cotton, Greg Bowden y Paul Soubiran por editar el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Werner Siemens-Fundación y la Facultad de Medicina de la Universidad Eberhard Karls de Tübingen ('' Promotionskolleg '') y por el DFG a través de la CRC 156 (proyecto C3).
Materials
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28×0.61mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | – | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | – | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | – | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100µl) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
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