This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.
Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) lover godt for sygdom modellering og regenererende behandlinger. Vi har tidligere beskrevet anvendelsen af Episomale vektorer (EV) for at generere integration-fri iPSCs fra mononukleære celler fra perifert blod (PB MNC'er). De episomale vektorer anvendes, er DNA-plasmider indarbejdet med oriP og EBNA1 elementer fra viruset Epstein-Barr (EB), som giver mulighed for replikation og langsigtet fastholdelse af plasmider i mammale celler. Med yderligere optimering kan opnås tusindvis af IPSC kolonier fra 1 ml perifert blod. To afgørende betydning for opnåelsen af høj omprogrammering effektivitetsgevinster er: 1) anvendelsen af en 2A "self-spaltning" peptid at linke OCT4 og SOX2 og således opnå ækvimolær udtryk for de to faktorer; 2) anvendelsen af to vektorer til at udtrykke MYC og KLF4 individuelt. Her beskriver vi en trin-for-trin-protokol til at generere integration-fri iPSC'er fra voksne perifere blodprøver. De genererede iPSCs er integration-fri som resterende episomale plasmider er målbart efter fem passager. Selvom omprogrammering effektivitet er sammenlignelig med Sendai-virus (SV) vektorer, EV plasmider er betydeligt mere økonomiske end de kommercielt tilgængelige SV vektorer. Denne prisbillige EV omprogrammering systemet rummer potentiale for kliniske anvendelser i regenerativ medicin og giver en tilgang til direkte omprogrammering af PB multinationale selskaber til integration uden mesenkymale stamceller, neurale stamceller osv.
Efter tvungen ekspression af adskillige transkriptionsfaktorer (Dvs. OCT4, SOX2, MYC og KLF4), kan somatiske celler omprogrammeres til induceret pluripotente stamceller (iPSCs), som holder meget lovende for applikationer i regenerativ medicin og celleudskiftning 1-3. Til dato er forskellige fremgangsmåder blevet udviklet til at forøge succesraten for omprogrammering 4-7. Virale vektorer induceret omprogrammering er meget brugt til effektiv generering af iPSCs, fordi viral integration fører til et højt niveau, stabil ekspression af omprogrammering faktorer. Permanent integration af vektor-DNA i cellegenomet, kan imidlertid inducere insertionsmutagenese 5. Desuden kan utilstrækkelig inaktivering af omprogrammering faktorer forstyrre iPSCs differentiering 8. Som sådan er anvendelsen af iPSCs uden integration af omprogrammering faktorer er bydende nødvendigt, specielt til brug i celleterapi applikationer.
<p class="jove_content"> Episomalt Vektorer (elbiler) er meget udbredt i den generation af integration-fri iPSCs. Den mest almindeligt anvendte EV er et plasmid indeholdende to elementer, oprindelse af viral replikation (oriP) og EB Nuclear Antigen 1 (EBNA1), fra viruset 9 Epstein-Barr (EB). OriP element fremmer plasmidreplikation i pattedyrceller, mens EBNA1 element bindsler oriP-indeholdende plasmid-DNA til det kromosomale DNA, der muliggør opdelingen af episom under opdeling af værtscellen. I sammenligning med andre integrationsrelevante fri strategier, herunder Sendai-virus (SV) og RNA transfektion elbiler besidder flere fordele 5,6,10. Som plasmid-DNA, kan elbiler let fremstilles og ændres i hus, hvilket gør dem yderst overkommelig. Desuden omprogrammering med EV er en mindre arbejdskrævende proces, da en enkelt transfektion med elbiler er tilstrækkelig til iPSC generation, mens der er nødvendige for en vellykket omprogrammering flere RNA transfektioner.DErmal fibroblaster er blevet anvendt i mange omprogrammering undersøgelser. Men hudbiopsi er ikke kun en invasiv og smertefuld proces, men også tidskrævende for at udvide celler til tilstrækkelige mængder til omprogrammering. Af større bekymring, har hudceller af voksne donorer ofte været udsat for langvarig UV-lys-stråling, som kan føre til mutationer associeret med tumorer, hvilket begrænser ansøgningerne om iPSCs afledt hud fibroblaster 11,12. For nylig er det blevet rapporteret, at normale menneskelige hudceller ophobes somatiske mutationer og flere kræft gener, herunder de fleste af de vigtigste drivkræfter for kutant planocellulært karcinom, er under stærk positiv selektion 13.
I modsætning til hudfibroblaster, perifert blod (PB) celler er en foretrukket kilde til celler til omprogrammering fordi 1) blodlegemer kan let opnås gennem en minimalt invasiv fremgangsmåde, 2) perifere blodlegemer er afkom af hæmatopoietiske stamcellerbopæl i knoglemarven, og dermed beskyttet mod skadelig stråling. Perifere mononukleære blodceller (PB MNC'er) kan opsamles i en time fra buffy coat lag efter en simpel gradient centrifugering under anvendelse af Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). De opnåede PB MNCs er sammensat af lymfocytter, monocytter og nogle hæmatopoietiske stamceller (HPCs) 14. Selvom humane T-lymfocytter er en af de største celletyper i PB, modne T celler indeholder omlejringer af T-cellereceptoren (TCR) gener og mangler et intakt genom således begrænser deres potentielle anvendelser 15,16. Foryngelse af T-celler via iPSC generation, kan dog have potentielle anvendelser i kimære Antigen receptor (CAR) T-celleterapi 17-19. Til sammenligning HPC'er har et intakt genom og er let reprogrammable. Selvom kun 0,01-0,1% celler i det perifere kredsløb er HPCs, kan disse celler udvides ex vivo i erythroid medium, der favoriserer spredning af erythrOID progenitorceller 14.
I vores tidligere undersøgelse, brugte vi den faktor BCL-XL i tillæg til de Yamanaka faktorer (OCT4, SOX2, MYC og KLF4), hvilket resulterede i en 10x stigning i PB omprogrammering efficency 20. BCL-XL, også kendt som BCL2L1, er en potent hæmmer af celledød, ved at inhibere aktivering af caspaser 21,22. Men, kan BCL-XL også spille en vigtig rolle i at opretholde pluripotens 21,22. For nylig har vi yderligere optimeret vores EV omprogrammering systemet ved separat udtrykke MYC og KLF4 med to vektorer, hvilket fører til en omtrent 100x stigning i omprogrammering effektivitet 23. Under anvendelse af denne metode, omprogrammering effektivitet defineret ved hjælp af koloni nummer divideret med start celletal ved transfektion, er 0,2 – 0,5% fra raske donorer. Som det fremgår, beskriver vi den detaljerede eksperimentelle procedure til at generere integration-fri iPSCs fra PB.
Erhvervelse blodprøver fra raske donorer eller patienter er praktisk og ikke-invasiv, hvilket gør det til et attraktivt celle kilde til grundforskning og klinisk celleterapi. Her har vi beskrevet en protokol for højeffektive generation af integration-fri iPSCs fra perifere blodprøver. Denne reproducerbar og billig tilgang bør gavne iPSC feltet.
Vi har rapporteret, at der er to kritiske faktorer, der er ansvarlige for den meget effektive PB omprogrammering 30. Den ene er ækvi…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).
Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma | S0192 | Store at 4 °C |
Human stem cell factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | Store at -20 or -80°C |
Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | Store at -20 or -80°C |
Eryrthropoietin (EPO) | Peprotech | 100-64 | Store at -20 or -80°C |
Insulin growth factor-1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | Store at -20 or -80°C |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | Store at -20 or -80°C |
1-thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | Store at -20 or -80°C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 112660-012 | Store at 4 °C |
L-glutamine (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C |
Non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140-050 | Store at 4 °C |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | Store at -20 or -80°C |
ITS (100x) | Gibco | 41400-045 | Store at 4 °C |
Ascorbic acid | Sigma | 49752 | Store at -20 °C |
DMEM (high glucose) medium | Thermo | SH30243.01B | Store at 4 °C |
FBS | Hyclone | SV30087.01 | Store at -40 °C |
Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | Store at RT |
Trehalose | Sigma | T9531 | Store at 4 °C |
DMSO | Sigma | D2650 | Store at RT, protect from light |
Endofree Plasmid Maxi Kit(10) | Qiagen | 12362 | Store at RT |
IMDM | Gibco | 21056-023 | Store at 4 °C |
Human CD34+ Cell Nucleofection Kit | Lonza | VPA-1003 | Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C |
Sodium butyrate | Sigma | B5887 | Store at -20 or -80°C |
ROCK inhibitor Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | Store at -20 °C |
Essential 8 basal medium (E8) | Gibco | A15169-01 | Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C |
Matrigel | BD | 354277 | Store at -20 or -80°C |
2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) | TransGen Biotech | AS111 | Store at -20 °C |
Cell detachment solution | STEMGENT | 01-0006 | Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension |
DAPI | Sigma | D9542-1MG | Store at 4 °C or -20 °C |
Anti-nanog-AF488 | BD | 560791 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
AF488 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A21202 | Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/500 when use |
PE anti-human TRA-1-60-R Antibody | Biolegend | 330610 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
Isotype antibody | eBioscience | 11-4011 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
Alkaline Phosphatase Detection Kit | SiDanSai | 1102-100 | Store at 4 °C |
Genomic DNA Extraction Kit | TIANGEN | DP304-02 | Store at RT |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | Store at RT |
Flow cytometry cell analyzer | BD | LSRII | for flow cytometry analysis |
Spinning disk confocal microscope (SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | for confocal imaging |
Nucleofection device | Lonza | Nucleofector 2b | for the nucleofection of PB MNC |
ImageQuant LAS-4010 | GE | take photo of AP staining in bulk |