Summary

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

Published: December 23, 2016
doi:

Summary

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Abstract

כרגע יש הרבה כלים כימיים זמינים להציג בדיקות כימיות לחלבונים ללמוד המבנה והתפקוד שלהם. שיטה יעילה היא הצמידה חלבון על ידי החדרה גנטית חומצת אמינו טבעית המכילה קבוצה פונקציונלית bioorthogonal. דו"ח זה מתאר פרוטוקול מפורט נטיית נוגדן אתר ספציפי. הפרוטוקול כולל פרטים ניסיוניים עבור שילוב הגנטי של חומצה תזיד המכיל אמינו, ותגובת הנטייה ידי cycloaddition אלקין-יזיד קדם-זן (SPAAC). התגובה זן-קידם זה ממשיך ידי ערבוב פשוט של מולקולות מגיבים ב- pH וטמפרטורה פיזיולוגיים, ואינו דורש ריאגנטים נוספים כגון יוני נחושת (אני) ו ligands chelating-נחושת. לכן, שיטה זו תהיה שימושית עבור נטיית חלבון בכלל ופיתוח של conjugates תרופת הנוגדן (ADC).

Introduction

מאז ההתאגדות הגנטית של -methoxyphenylalanine p ב Escherichia coli נמסרה, 1 יותר מ -100 חומצות אמינו לא טבעיות (UAAs) שולבו בהצלחה לחלבונים שונים. 1-3 בין UAAs אלה, חומצות אמינו המכילות קבוצות פונקציונליות bioorthogonal נחקרו רבות ומייצגים את השיעור הגבוה ביותר. הקבוצות הפונקציונליות bioorthogonal המשמשים UAAs כוללים קטון, 4 אזיד, 5 אלקין, 6 cyclooctyne, 7 tetrazine, 8 α, β אמיד-בלתי רוויות, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 ו bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 למרות כל קבוצה פונקציונלית יש יתרונות וחסרונות, חומצות אמינו המכיל תזדנה שמשו בצורה המקיפה ביותר עבור נטיית חלבון. p -Azidophenylalanine (AF), אחת מחומצות אמינו המכיל azido, זמין, ו effic התאגדותהiency מצוין. חלבונים Mutant המכיל חומצת אמינו זו ניתן הגיבו עם alkynes ידי cycloaddition היה הזרז נחושת או עם cyclooctynes ​​ידי SPAAC. 12-20

לאחרונה, תרופות ביולוגיות היו למשוך תשומת לב רבה בתעשיית התרופות. המצומד נוגדן-תרופה (ADC) היא מחלקה של נוגדנים הטיפוליות הקיימות יתרון בשל יכולתם לטיפול ממוקד לטיפול בגידולים בבני אדם 21 מחלות אחרות. יותר מ -50 ADCs כרגע בניסויים קליניים, והמספר גדל במהירות. בפיתוח של ממירי ADC, גורמים רבים צריכים להילקח בחשבון על מנת למקסם את היעילות ולצמצם את תופעות הלוואי. בין גורמים אלה, תגובת נטייה יעילה באתר ספציפי כדי ליצור קשר קוולנטי בין נוגדן ותרופה היא קריטית. היעילות הרצויה וספציפי תגובת הנטייה יכולים להיות מושגת על ידי נטייה עם קבוצה פונקציונלית bioorthogonal בביתחומצת אמינו טבעית אשר משולבת באופן ספציפי נוגדן. הנה 22-26, אנו מדווחים פרוטוקול אתר ספציפי לשלב AF לתוך נוגדן ו להטות שבר נוגדנים מוטציה עם בדיקה ביוכימית.

Protocol

1. בניית פלסמיד לבנות פלסמיד ביטוי (pBAD-HerFab-L177TAG) שיבטא את הגן נוגדן היעד (pBAD-HerFab-WT) עם -tag 6 שלו, ולהחליף את קודון עבור לאוצין-177 עם קודון ענבר (TAG) 27, באמצעות טכניקת mutagenesis אתר מכוון קונבנציונלית. ראה טב…

Representative Results

במחקר זה, מקטע נוגדן היה האתר ספציפי מצומדות עם fluorophore על ידי שילוב של חומצות אמיניות המכילים תזדנה לתוך שהבר ותגובת שבר נוגדני המוטציה עם cyclooctyne מתוח (איור 1). HerFab נבחרה נוגדן היעד שלתוכו AF התאגד חומצת אמינו תזיד המכיל. כדי לבחור את שאריות…

Discussion

השילוב הגנטי של חומצות אמינו לא טבעיות לחלבונים יש מספר יתרונות על פני שיטות אחרות משמשות שינוי חלבון. 1-3 אחד היתרונות החשובים הוא התחולה הכללית שלה לכל סוג של חלבון. באופן עקרוני, אין הגבלה בבחירת חלבון מטרה ואתר היעד של החלבון. עם זאת, החלפת משקע מבני או תפקודי …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Materials

1. plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRS Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1g
LB Broth BD Difco 244620 500g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25g
Agar SAMCHUN 214230 500g
SOC medium Sigma S1797 100ML
3. Expression and purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF) Bachem F-3075.0001 1g
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500ml
3.2 Cell lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% SAMCHUN E0064 1kg
Sucrose Sigma S9378 500g
Lysozyme Siyaku 126-0671 1g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25ml
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1ml capacity
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10ml
MES running buffer Thermofisher NP0002 500ml
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25g
Typhoon 9210 variable mode imager Amersham Biosciences

Riferimenti

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -. J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -. J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, h. J., Kim, D. W., Lee, h. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

Play Video

Citazione di questo articolo
Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H. S. Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition. J. Vis. Exp. (118), e54922, doi:10.3791/54922 (2016).

View Video