codificado genéticamente-histona-miniSOG induce mutaciones hereditarias en todo el genoma de una manera dependiente de la luz azul. Este método de mutagénesis es simple, rápido, libre de productos químicos tóxicos y muy adecuado para la detección genética hacia adelante y la integración del transgén.
Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.
Pantallas adelante genéticos han sido ampliamente utilizados para generar mutantes genéticos de alteración diversos procesos biológicos en organismos modelo tales como Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Los análisis de los mutantes de este tipo conducen al descubrimiento de genes funcionalmente importantes y sus vías de señalización 1,2. Tradicionalmente, la mutagénesis en C. elegans se consigue utilizando productos químicos mutagénicos, radiación o transposones 2. Los productos químicos tales como metanosulfonato de etilo (EMS) y N-etil-N -nitrosourea (ESN) son tóxicos para los seres humanos; rayos gamma o ultravioleta (UV) mutagénesis radiación requiere equipo especial; y las cepas de tipo transposón activo, tales como cepas mutantes 3, pueden causar mutaciones innecesarios durante el mantenimiento. Hemos desarrollado un método simple para inducir mutaciones hereditarias utilizando un fotosensibilizador codificado genéticamente-4.
Especies reactivas del oxígeno (ROS) pueden dañar el ADN 5.El generador de mini oxígeno singlete (miniSOG) es una proteína verde fluorescente de 106 aminoácidos que fue diseñado a partir de la lista de valores (luz, oxígeno, y voltaje) de dominio de Arabidopsis phototropin 2 6. Tras la exposición a la luz azul (~ 450 nm), miniSOG genera ROS incluyendo oxígeno singlete con fl avin mononucleótido como cofactor 6-8, que está presente en todas las células. Hemos construido una proteína de fusión His-MSOG mediante el etiquetado de miniSOG a la C-terminal de la histona-72, un C. elegans variante de la histona 3. Hemos generado un transgén de una sola copia 9 para expresar Su-MSOG en la línea germinal de C. elegans. En condiciones normales de cultivo en la oscuridad, los gusanos transgénicos Su-MSOG tiene la cría de tamaño normal y duración de la vida 4. Tras la exposición a la luz LED azul, los gusanos Su-MSOG producen mutaciones hereditarias entre su progenie 4. El espectro de mutaciones inducidas incluye cambios de nucleótidos, tales como G: C a T: A y G: C a C: G, y los pequeños chromosoMe supresiones 4. Este procedimiento de mutagénesis es fácil de realizar y requiere una configuración mínima seguridad en el laboratorio. A continuación, se describe la configuración de la iluminación LED y procedimientos para la mutagénesis optogenético.
A continuación, describimos un procedimiento detallado de mutagénesis usando optogenético Su-MSOG expresa en la línea germinal y proporcionar un ejemplo de una pantalla genética hacia delante pequeña escala. En comparación con mutagénesis química estándar, este método de mutagénesis optogenético tiene varias ventajas. En primer lugar, es no tóxico, manteniendo de esta manera el personal de laboratorio fuera de mutágenos químicos tóxicos como el EMS, ENU y trimetilpsoraleno con luz ultravioleta (TMP / UV…
The authors have nothing to disclose.
The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.
Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O) | Sigma | C6641 | |
Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
NGM plate | Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0). | ||
Lysis solution | 10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K |