Summary

Realizzazione di un UV-Vis e Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Published: November 10, 2016
doi:

Summary

Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.

Abstract

Immunodosaggi sono utilizzati per rilevare le proteine ​​in base alla presenza di anticorpi associati. A causa del loro ampio utilizzo nella ricerca e ambito clinico, una grande infrastruttura di strumenti e materiali immunodosaggio può essere trovato. Ad esempio, 96 e 384 e lastre di polistirene sono disponibili in commercio e hanno un design standard per ospitare ultravioletti visibile macchine spettroscopia (UV-Vis) di diversi produttori. Inoltre, una vasta gamma di immunoglobuline, tag di rilevamento, e agenti bloccanti per i disegni personalizzati per prove immunologiche come la metodica immunoenzimatica (ELISA) sono disponibili.

Nonostante l'infrastruttura esistente, i kit ELISA standard non soddisfano tutte le esigenze di ricerca, che richiede lo sviluppo immunologico individualizzato, che può essere costoso e richiede molto tempo. Ad esempio, i kit ELISA hanno bassa multiplexing (rilevamento di più di un analita in un momento) funzionalità come di solito dipendono fluorescenza o colmetodi orimetric per il rilevamento. Colorimetrici ed analisi fluorescenti a base hanno limitate capacità di multiplexing a causa di ampi picchi spettrali. Al contrario, Raman metodi spettroscopia basati hanno una maggiore capacità di multiplexing a causa di picchi di emissione strette. Un altro vantaggio della spettroscopia Raman è che i giornalisti Raman esperienza significativamente meno photobleaching di tag fluorescenti 1. Nonostante i vantaggi che i giornalisti Raman hanno più tag fluorescenti e colorimetriche, protocolli per fabbricare test immunologici Raman-based sono limitati. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per preparare sonde funzionalizzati da utilizzare in combinazione con lastre di polistirene per il rilevamento diretto di analiti di analisi UV-Vis e spettroscopia Raman. Questo protocollo permetterà ai ricercatori di adottare un approccio fai-da-te per il futuro il rilevamento multi-analita mentre capitalizzando sulle infrastrutture prestabilito.

Introduction

immunodosaggi panino tipici indirettamente rilevano la presenza di un antigene usando due anticorpi. L'anticorpo di cattura è legato ad una superficie solida e forma un complesso antigene-anticorpo quando in prossimità di un antigene appropriato. Un anticorpo di rilevazione viene quindi introdotto e si lega all'antigene. Dopo il lavaggio, i / antigene / anticorpo resti complessi di anticorpi e viene rilevato dal anticorpo di rilevazione etichettato come mostrato nella Figura 1A. Rilevamento Tipica è fatto da un rivelatore a fluorescenza o colorimetrico, limitando multiplexing a 10 analiti causa di ampi picchi spettrali 2,3. Al contrario, i sistemi basati su Raman hanno molto stretti picchi di emissione con conseguente capacità di multiplexing avanzate con le fonti che sostengono il rilevamento simultaneo di fino a 100 analiti 2,3.

Molte fonti bibliografiche sono disponibili che coprono importanti aspetti relativi alla saggi immunologici 4-6 come passo-passodettagli per creare kit personalizzati ELISA. Purtroppo, questi protocolli sono per il rilevamento a fluorescenza o colorimetrico, limitando la capacità di multiplexing di saggi immunologici personalizzati. Per rispondere a questa esigenza, vi presentiamo una procedura dettagliata per fabbricare l'UV-Vis / Raman immunologico pubblicato in precedenza 7 per un test immunologico diretta come illustrato nella figura 1B.

Questo protocollo comprende la fabbricazione di sonde a base di nanoparticelle di oro funzionalizzato, illustrata in figura 2. La procedura per effettuare le sonde / UV-Vis Raman inizia legandosi reporter Raman alla superficie di nanoparticelle di oro (AuNPs). I AuNPs vengono funzionalizzati con anticorpi che sono associati con polietilenglicole (PEG). Restanti siti di legame sulle AuNPs sono bloccati dal legame metossi tiolo polietilene glicole (MPEG-SH) per AuNPs per evitare la successiva legame non specifico durante l'analisi. Le sonde AUNP preparati sono testati legandosi agli antigenifissato ai pozzetti di una piastra di polistirene come illustrato in Figura 1B. Al lavaggio del piatto, le sonde AUNP vengono rilevati utilizzando la spettroscopia UV-Vis, mentre i reporter Raman associati vengono rilevati con spettroscopia Raman. La combinazione di UV-Vis e Raman spettrale dei dati fornisce due metodi di analisi, migliorando le capacità di questo test immunologico.

Protocol

1. Preparazione del buffer Tampone fosfato (PBS) Diluire 50 ml di 10x PBS con 450 ml di acqua di grado HPLC per fare una concentrazione 1x PBS. filtro sterile la soluzione con un filtro di 0,22 micron. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. Preparazione di Tris Buffered Saline + Tween 20 (TBST) Diluire 50 ml di 10x Tris Buffered Saline (TBS) con 450 ml di acqua di grado HPLC per fare una concentrazione 1x. Aggiungere 25…

Representative Results

In questo studio, 60 particelle di oro nm sono stati usati per spettroscopia UV-Vis. UV-Vis spettri di assorbimento da 400 a 700 nm sono stati raccolti e le aree dei picchi per ciascuna concentrazione AUNP sono stati determinati utilizzando un sistema open source software di analisi spettrale 8. Prima di picco integrazione, gli spettri raccolto subito correzione al basale utilizzando un polinomio tre punti. Aree dei picchi sono stati usati per generare una curva di calibrazione logaritmica come mostrato nella…

Discussion

Nel protocollo dettagliato, ci sono diversi punti critici da affrontare. Un problema è la scelta di Raman giornalista e nanoparticelle d'oro. Anche se il protocollo è stato scritto per essere adattato per l'uso individuale, il giornalista Raman DTTC è stato utilizzato come esempio. DTTC è un reporter carico positivamente e si lega a superfici come citrato innevate AuNPs carica negativa. Questo protocollo può essere adattato per giornalisti caricati negativamente utilizzando nanoparticelle di oro con una car…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.

Materials

60nm Gold Nanoparticle Ted Pella, Inc. 15708-6 These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Methanol Pharmco-Aaper 339000000
Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 Scy Tek TBD999
Bottle Top Filtration Unit VWR 97066-202
Tween 20 (polysorbate 20) Scy Tek TWN500 Used as an emulsifying agent for washing steps.
Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 Scy Tek PBD999
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf Tubes 22431102 LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf Tubes 22431064 LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Microplate Devices UniSeal GE Healthcare 7704-0001 Used for sealing and storing functionalized plates.
Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom Costar 3370
HPLC grade water Sigma Aldrich 270733-4L
3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) Sigma Aldrich 381306-250MG Raman reporter
mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram Laysan Bio, Inc. MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram Laysan Bio, Inc. OPSS-PEG-SVA-5000-1g OPSS-PEG-SVA has an NHS end.
Mouse IgG, Whole Molecule Control Thermo Fisher Scientific 31903 Antigen
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher Scientific 31164 Antibody
Human Serum Albumin Blocking Solution Sigma Aldrich A1887-1G Bovine serum albumin can be used instead.
In-house built 785nm inverted Raman microscope unit N/A N/A An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used.
Mini Centrifuge Fisher Schientific 12-006-900
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000c
UV-Vis Spectrophotometer BioTek Synergy 2
Desalting Columns Thermor Scientific 87766

Riferimenti

  1. Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
  2. Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
  3. Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
  4. . . The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , (2013).
  5. Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , (2004).
  6. . . ELISA development guide. , (2016).
  7. Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
  8. Menges, F. . Spekwin32 – optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , (2016).
  9. Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
  10. Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
  11. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
  12. . . EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, (2012).
  13. Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
  14. Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
  15. Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
  16. Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
  17. McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).

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Citazione di questo articolo
Hanson, C., Israelsen, N. D., Sieverts, M., Vargis, E. Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform. J. Vis. Exp. (117), e54795, doi:10.3791/54795 (2016).

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