Summary

Мышиной модели группы B<em> Streptococcus</em> Вагинальный Колонизация

Published: November 16, 2016
doi:

Summary

Целью этого протокола является подражать человеческой группы B стрептококк (СГБ) вагинальный колонизацию в мышиной модели. Этот метод может быть использован для исследования иммунного ответа и бактериальные факторы, способствующие GBS вагинального настойчивость, а также для тестирования терапевтических стратегий.

Abstract

Streptococcus agalactiae (стрептококки группы В, ГБС), представляет собой грамположительные, бессимптомно колонизатор человеческого желудочно – кишечного тракта и вагинального тракта 10 – 30% взрослого населения. В ослабленным иммунитетом лиц, в том числе новорожденных, беременных женщин и пожилых людей, GBS может переключиться на инвазивный возбудителем сепсис, артрит, пневмония и менингит. Поскольку GBS является ведущим бактериальный возбудитель новорожденных, профилактика тока состоит из позднего скрининга гестации для GBS вагинальной колонизации и последующего перипартальной лечения антибиотиками GBS-инфицированных матерей. Тяжелые GBS вагинальные бремя является фактором риска как заболевания у новорожденных и колонизации. К сожалению, мало известно о хозяине и бактериальных факторов, которые способствуют или разрешают GBS вагинальные колонизации. Этот протокол описывает способ для установления стойких GBS вагинальный колонизацию с использованием одного бета-эстрадиол предварительную обработку и отбор суточных проб для определения бактериальной лоаd. Кроме того, он подробно методы администрирования дополнительных методов лечения или реагентов, представляющих интерес и для сбора промывание влагалища жидкости и тканей половых путей. Эта модель мыши будет способствовать пониманию GBS-хозяина взаимодействия в среде влагалища, что приведет к потенциальным терапевтических мишеней для контроля материнской колонизации во влагалище во время беременности и для профилактики передачи ВИЧ уязвимого новорожденного. Он также будет представлять интерес для улучшения нашего понимания общих взаимодействий бактериально-хозяевах в женском влагалище.

Introduction

Streptococcus agalactiae, стрептококки группы В (GBS), представляет собой инкапсулированный, грамположительные бактерии , которая часто выделяемыми из кишечника и мочеполового тракта здоровых взрослых. В 1970 – е годы, GBS появился в качестве ведущего агента инфекционного неонатальной смертности, с более чем 7000 случаев заболевания у новорожденных в год 1. Раннее начало болезни GBS (ОВБ) происходит в первые часы или дни жизни, возникает как пневмония или дыхательной недостаточности, и часто развивается в сепсисом, в то время как с поздним началом заболевания (LOD) наступает через несколько месяцев и подарки с бактериемией, которые часто переходит к менингиту 2. По состоянию на 2002, Центры по контролю и профилактике заболеваний рекомендует всеобщий скрининг для GBS вагинальной колонизации в конце беременности и в родах антибиотикопрофилактики (IAP) для GBS-положительных матерей 1. Несмотря на снижение заболеваемости раннего начала до приблизительно 1000 случаев в Соединенных Штатах ежегодно из-за IAP,GBS остается ведущей причиной раннего начала неонатального сепсиса, и появление с поздним началом остается неизменным 1. Будь внутриутробно, во время родов или даже в поздним началом случаях, неонатальный воздействие GBS требует выживания, поперечный с помощью ряда сред-хозяев и барьеров, иммунной уклонения, а также, в случае менингита, пересечения высоко регулируемой гематоэнцефалического гематоэнцефалический барьер 2. Вверх по течению этих сильнодействующих взаимодействий внутри новорожденному является начальным колонизация влагалища матери-кишечного тракта. Материнское GBS вагинальных колонизация колеблется от 8-18% в развитых и развивающихся странах, с предполагаемой средней ставке 12,7% 3,4. GBS колонизация вагинального тракта во время беременности может быть постоянным, прерывистым, или временный характер среди отдельных женщин 5. Интересно, что материнский возраст> 36 лет связана с постоянной колонизации 6. Многочисленные биологические и социально-экономические факторы риска для GBS вагинальной колонизациибыли идентифицированы. Биологические факторы включают желудочно – колонизацию GBS и отсутствие лактобактерий в кишечнике. Тем не менее, этническая принадлежность, ожирение, гигиена, и сексуальная активность также были связаны с GBS вагинального перевозки 7.

Хотя пресловутая за причинение неонатальных инфекций, GBS также вызывает множество материнских инфекций как послеродовых и после родов. ГБС каретка увеличивается в женщин с вагинитом 8 и, в некоторых случаях, может быть даже сущности болезни 9. Кроме того, GBS вознесение репродуктивного тракта во время беременности может привести к интраамниальной инфекции или хориоамнионита 10. Кроме того, в до 3,5% беременностей, GBS распространяет в мочевой пузырь , чтобы вызвать инфекцию мочевых путей или бессимптомной бактериурии 11. GBS бактериурии во время беременности связано с повышенным риском интранатального лихорадки, хориоамнионита, преждевременных родов и prematurе разрыв плодных оболочек 12. Взятые вместе, присутствие GBS в вагинального тракта связана с инфекциями нескольких тканей хозяина, а также возможность устранить GBS из этой ниши крайне важно как для здоровья матерей и новорожденных.

До недавнего времени большая часть работы следственным GBS взаимодействия с шеечно -кишечного тракта было ограничено в пробирке клеточных моделей 13-15. Эти эксперименты в пробирке показали бактериальные факторы , которые являются важными для присоединения, в том числе поверхностных белков , таких а и серин пили богатые повторы 17,18, а также двухкомпонентные системы регулирования 15,19 и глобальная реакция транскрипционной вагинального эпителия GBS 19. Вместе с тем, чтобы в полной мере выяснить хост-микробных взаимодействий внутри влагалищного тракта, надежная модель животного необходимо. Ранние работы показали , что ГБС может быть извлечена из вагинального тракта засеянных мышей и крыс 20,21 <SUP> 22 в обоих беременных и небеременных условиях. В 2005 году краткосрочные GBS вагинальные колонизация была смоделирована на мышах , чтобы изучить эффективность фага литического фермента для лечения вагинального GBS в течение 24 ч 23. Несколько лет спустя, долгосрочный GBS вагинальные колонизация мышиная модель была разработана с целью изучения хозяина и бактериальные факторы, определяющие GBS настойчивость. Эта модель выявила многочисленные факторы , способствующие GBS колонизации, в том числе поверхностных придатков 17,18 и GBS двухкомпонентных систем 19,24. Эта модель способствовала выявлению механизмов 19,25 ответа хозяина и был использован для тестирования несколько терапевтических стратегий, в том числе иммуномодулирующих пептидов 26 и пробиотиков 27. Этот протокол дает необходимые указания привить GBS в мыши вагинального тракта и впоследствии отслеживать колонизацию и собирать образцы для дальнейших анализов.

Protocol

Все для животных работа была одобрена Управлением Лабораторный уходу за животными в Сан-Диего государственного университета и проводится в соответствии с принятыми стандартами ветеринарные. Самок мышей, возраст 8 – 16 недель, были использованы для разработки этого метода. 1. Подгото?…

Representative Results

При разработке этой модели, многочисленные наблюдения были сделаны в отношении факторов, которые влияют на продолжительность GBS вагинальной колонизации. Для того, чтобы определить, каким образом эстрального этап при инокуляции воздействий GBS бактериальной персистен…

Discussion

В целях дальнейшего улучшения положения понимания GBS взаимодействия с хоста и других микробов в контексте хоста, требуется модель животного. Эта работа описывает технические аспекты создания GBS вагинальный колонизации у мышей. Этот протокол достигает> 90% колонизацию мышей без примен…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the vivarium manager and staff at San Diego State University for support with animal husbandry. During this work, K.A.P. was supported by an ARCS scholarship and a fellowship from the Inamori Foundation. K.S.D. is supported by an R01 grant, NS051247, from the National Institutes of Health.

Materials

Sesame oil  Sigma Aldrich S3547-250ML
β-Estradiol  Sigma Aldrich E8875-1G CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. 
200 μL gel loading pipette tips  USA Scientific 1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs Puritan 25-801 A 50
CHROMagar StrepB DRG International SB282
Todd Hewitt Broth Hardy Diagnostics 7161C
18 G, 1.5 inch needles BD 305199
26 G, 0.5 inch needles BD 305111
10 mL syringes BD 309604
1 mL syringes BD 309659
0.45 μm PVDF syringe filters Whatman 6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X Corning 21-031-CV

Riferimenti

  1. Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease–revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
  2. Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
  3. Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
  4. Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
  5. Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
  6. Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
  7. Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
  8. Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
  9. Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis?. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
  10. Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
  11. Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
  12. Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes?. J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
  13. Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
  14. Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
  15. Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
  16. Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
  17. Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
  18. Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
  19. Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
  20. Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
  21. Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
  22. Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
  23. Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
  24. Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
  25. Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
  26. Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
  27. Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
  28. Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, 534-535 (2004).
  29. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 48, A.4I.1-A.4I.8 (2009).
  30. Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
  31. Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
  32. Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
  33. Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
  34. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  35. Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
  36. Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
  37. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
  38. Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
  39. Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
  40. Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
  41. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
  42. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
  43. Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
  44. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
  45. Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
  46. Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).

Play Video

Citazione di questo articolo
Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (117), e54708, doi:10.3791/54708 (2016).

View Video