Summary

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Published: October 30, 2016
doi:

Summary

Eine einfache und zuverlässige Methode wird hier beschrieben eine Reihe von NK-Zellfunktionen wie Degranulierung, Zytokin und Chemokin-Produktion in verschiedenen NK-Zelluntergruppen zu analysieren.

Abstract

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introduction

Als Teil beitragen des angeborenen Immunsystems natürlichen Killerzellen (NK) in die erste Verteidigungslinie gegen virusinfizierten oder bösartig transformierten Zellen. Ein System von hemmenden und aktivierenden Rezeptoren ermöglicht es ihnen, zwischen gesunden und transformierten Zellen ohne vorherige Antigen Priming im Gegensatz zu T-Zellen zu unterscheiden. Bei der Zielzelle Begegnung lösen NK – Zellen , den Inhalt ihrer zytotoxischen Granula (zB Perforin, Granzyme) in die Immunsynapse ihr Ziel zu töten. Außerdem produzieren NK – Zellen und sekretieren verschiedene Arten von Cytokinen ( zum Beispiel Interferon γ: IFN-γ, Tumor – Nekrose – Faktor-α: TNF-α) und Chemokine ( zum Beispiel Makrophagen – Entzündungsprotein-1β: MIP-1β) , auf Zielzelle Interaktion oder Zytokinstimulation 1.

Eine ausreichende NK-Zell-Funktionen wie Zytotoxizität, Chemokin und Zytokin-Produktion haben einen wichtigen Einfluss auf das Schicksal verschiedener diserleichtert. Leukämie – Patienten zeigen Rezidivraten erhöht , wenn sie ein defektes NK – Zell – Profil bei der Diagnose , bestehend aus reduzierten IFN-γ Produktion und eine verminderte Expression von aktivierenden NK – Zell – Rezeptoren 2 aufweisen. Eine frühe Erholung der NK – Zellzahlen und Funktion einschließlich Cytokin – Produktion bei der Zielzelle Interaktion mit einem reduzierten Rückfall und eine verbesserte Überlebensrate bei Patienten mit allogener Stammzelltransplantation 3 verbunden. Außerdem können zu Beginn einer Interferon – Therapie in hepatitis C virus-infizierten Patienten die Degranulation peripherer Kapazität NK – Zellen ist stärker in frühen als Responder in Non-Responder 4. NK – Zellzahlen (> 80 / ul) am Tag 15 nach autologer Stammzelltransplantation (autoSCT) bei Patienten mit Lymphom oder Multiplem Myelom leiden , sind prädiktiv für eine verbesserte progressionsfreie und das Gesamtüberleben 5. In Melanom-Patienten die Expression des T-Zell-Immunglobulin und Mucin-domain-mit deg Molekül-3 (TIM-3), ein Immun-Regulationsprotein auf NK – Zellen korreliert mit dem Krankheitsstadium und Prognose 6.

Wissenschaftler haben in den letzten Jahrzehnten NK-Zell-Funktionen überwacht. Die erste Analyse der NK – Zell – Zytotoxizität gegen Tumorzellen ohne vorherige Grundierung wurde eine 51 Cr-Freisetzungstest 7 angesprochen. In jüngerer Zeit entwickelte Wissenschaftler eine nicht-radioaktive Verfahren die Zytotoxizität von NK – Zellen erweitert 8 zu bewerten. Zytokin und Chemokin Herstellung häufig bewertet wurde 9,10 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Techniken. Während der letzten Jahrzehnte haben sich diese Methoden durch Durchflusszytometrie basierenden Assays ergänzt. Die Verwendung von Protein – Transport – Inhibitoren (beispielsweise Brefeldin A und Monensin) und Zellpermeabilisierung Methoden in Kombination mit konventionellen Oberflächen Färbeprotokollen haben Wissenschaftler aktiviert Chemokin und Cytokin – Produktion in verschiedenen spezifischen Lymphe zu studierenocyte Teilmengen (beispielsweise T, B oder NK Zellen) 11. Außerdem verschiedene Durchflusszytometrie basierenden Assays wurden entwickelt, T und NK-Zell-Cytotoxizität zu überwachen. 2004 Alter et al. Beschrieben , um die Oberflächenexpression des Lysosom-assoziiertes Protein CD107a (Lamp1) auf NK – Zellen auf Zielzellen – Treffen als Marker für die Degranulation von zytotoxischen Granula 12. Da eine breite Palette von unterschiedlichen Fluorochromen und Multi-Channel-Durchflusszytometer in unseren Tagen zur Verfügung stehen, ist es möglich geworden, gleichzeitig diverse NK-Zell-Funktionen (Zytotoxizität, Zytokin und Chemokin-Produktion) in verschiedenen NK-Zell-Subpopulationen zu überwachen. Dies wird besonders wichtig in Situationen , in denen Probengröße begrenzt ist, beispielsweise in Biopsien oder Blutproben von Patienten mit Leukopenie leiden.

Um zu testen, Funktionen global NK-Zellen, die verschiedenen Durchflusszytometrie basierende Tests effizient kombiniert werden. Theorell et al. Stimulierte NK – Zellen aus HEAlthy Spender mit der Tumorzelllinie K562 und analysiert NK – Zell – Degranulation, inside-out – Signal und Chemokin – Produktion über die Durchflusszytometrie 13. Kürzlich NK-Zell-Untergruppen, Phänotypen und Funktionen in Tumorpatienten während autoSCT wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert basierte Assays. Es konnte gezeigt werden, dass NK – Zellen in der Lage waren Zytokinen / Chemokinen auf Tumorzellerkennung in sehr frühen Zeitpunkten nach der autoSCT 11 bis degranulieren und produzieren.

Hier ist ein Protokoll beschrieben NK Zellfunktionen bei Wechselwirkung mit Tumorzellen einschließlich Degranulation Kapazität, Chemokin und Cytokin-Produktion unter Verwendung einer Durchflusszytometrie-basierten Assays zu bewerten, die es möglich macht, NK-Zell-Funktionen in verschiedenen Teilmengen gleichzeitig zu überwachen.

Protocol

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Ethikkommission der Universität Frankfurt durchgeführt. 1. Anzucht von K562-Zellen Kultur K562 Zellen in R10 Medium (RPMI1640 – Medium mit Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin, 10% fötales Kälberserum) bei einer Dichte von 0,5-1 x 10 6 Zellen pro ml in einem Zellkulturkolben bei 37 ° C und 5% CO 2. Ernte-K562-Zellen 24 Stunden vor dem Beginn einer neuen Experiment. Entfernen des Zellkulturko…

Representative Results

Die Gating – Strategie zur Analyse der Degranulation, Zytokin und Chemokin Herstellung der gesamten NK – Zellpopulation und drei verschiedene NK – Zelluntergruppen sind in Abbildung 1 dargestellt. Repräsentative Ergebnisse eines gesunden Spenders sind in Abbildung 2 dargestellt. NK – Zellen ohne Stimulus erzeugt weder IFN-γ oder MIP-1β und nicht CD107a auf ihrer Oberfläche (2…

Discussion

Das beschriebene Verfahren ist eine einfache, schnelle und zuverlässige Ansatz NK-Zell-Funktionen aus Vollblut von gesunden Spendern oder Patienten zu untersuchen. Dieses Verfahren bietet den großen Vorteil, direkt NK – Zellen aus Vollblut zu reinigen, die Vermeidung der zeitraub Dichtegradientenzentrifugation, die für viele andere Reinigungsverfahren 15 vorgeschrieben ist. Außerdem erfordert es eine kleinere Größe Probe im Vergleich zu "klassischen" NK-Zell-Isolation / Anreicherungsverfahren,…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Materials

RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

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Citazione di questo articolo
Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

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