Bacterial Affichage intérieur-membrane pour le criblage d'une bibliothèque de fragments d'anticorps

1. Préparer la bibliothèque scFv comme Fusion à la séquence signal ssTorA Obtenir une banque d'acide désoxyribonucléique (ADN) contenant des variants d'un gène scFv. REMARQUE: La bibliothèque peut également être construit en utilisant un mode approprié pour générer de la diversité sur le gène scFv entier ou des domaines ciblés 22 (par exemple, la troisième régions déterminant la complémentarité, CDR3.). Insérer la banque d'ADN dans le plasmide pimd (figure 2) en utilisant des procédés de clonage moléculaire standard 23. Remarque: Ce plasmide exprime scFv comme une fusion génétique à la séquence signal ssTorA (N-terminal scFv) et le marqueur d'epitope FLAG (C-terminale du scFv). La conception du plasmide pour l' affichage de la membrane interne a été décrit précédemment 19. Le plasmide pimd est disponible auprès des auteurs. <br/> Figure 2. Inner-membrane affichage plasmide (PIMD) carte (étapes 1.2 à 1.3). Ce plasmide contient un promoteur lac, l' origine ColE1 de réplication, et un gène de résistance au chloramphénicol. Le gène inséré scFv est fusionné à la séquence signal pour cibler ssTorA scFv à la voie Tat et à un marqueur d'epitope FLAG, avec toutes les trois dans le même cadre de lecture. les sites d'enzymes de restriction sont indiqués. Pour une bibliothèque insérée entre les sites d'enzymes de restriction Xbal et Notl, la taille du plasmide est 2219 pb plus la taille du scFv. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Transformer l'ADN plasmidique contenant la banque dans MC4100 de E. 23 cellules de E. coli. Récupérer et développer cette forme bactérienne de la bibliothèque. Centrifuger à 4000 xg pendant 15 min à température ambiante pour recueillir les cellules. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules recueilliesdans 25% de glycérol dans Luria-Bertani (LB) médias. aliquotes Conserver à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire, ou passez à l'étape 2. NOTE: Le protocole a été vérifié avec des cellules MC4100, bien que d' autres E. souches coli devraient également être compatibles avec le protocole. L'électroporation est la méthode préférée pour la transformation, en raison de sa grande efficacité de transformation. La bibliothèque devrait typiquement être composé d'au moins 10 9 variantes scFv à ce stade, et chaque aliquote doit contenir suffisamment de cellules de telle sorte que la bibliothèque est recouverte de 100 fois. 2. Exprimer la Bibliothèque et Préparer sphéroplastes Décongeler une aliquote de la banque bactérienne (étape 1.3) à la température ambiante, et à l'aliquote à un flacon contenant 100 ml de milieu LB avec 20 ug / ml de chloramphenicol (Cm). Développer pendant 3 heures à 37 ° C et à 225 tours par minute dans un agitateur incubé. Après 3 heures, enlever le ballon de l'agitateur incubé 37 ° C. Permettre l'expression de la bibliothèque de scFvprocéder O / N pendant 15-22 heures à 20 ° C et à 225 tours par minute dans un agitateur incubé. REMARQUE: Aucun inducteur est nécessaire lors de l'utilisation du plasmide pimd, comme le promoteur est percé. Notez que les cellules MC4100 ne surexpriment le répresseur Lac (et Lad est introuvable sur le plasmide). Figure 3. cellules de E. coli et sphéroplastes. (A) E. cellules coli sont de forme cylindrique. (B) Après sphéroplastes à l' aide de l' EDTA et du lysozyme, la membrane externe de E. cellules coli est rompu, et les sphéroplastes résultants sont de forme sphérique. Contraste interférentiel différentiel (DIC) des images de microscopie ont été obtenues en utilisant un objectif 100X sur un microscope inversé. S'il vous plaît clécher ici pour voir une version plus grande de cette figure. Préparer les sphéroplastes de la bibliothèque. REMARQUE: Les sphéroplastes sont formés par la rupture de la membrane externe de E. coli et sont de forme sphérique (Figure 3). Préparer les tampons nécessaires. REMARQUE: Tous les tampons doivent être stériles. Préparer 1 x tampon phosphate salin (PBS; pH 7,4) en dissolvant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 et 0,24 g de KH 2 PO 4 dans H2O distillée jusqu'à un volume final de 1000 ml. Gardez sur la glace. Préparer PBS avec 0,1% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) en dissolvant 0,2 g de BSA dans 200 ml de 1 x PBS. Gardez sur la glace. Préparer le tampon de fractionnement (FB) en mélangeant 7,5 ml d' eau filtrée stérilement 1 M de saccharose, 1 ml de tampon Tris 1 M (pH 8,0) et 1,5 ml d' eau distillée 2 O. Gardez sur la glace. Préparer 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) en ajoutant 30 ul of EDTA 0,5 M à 14,97 ml d'eau distillée H 2 O. Préparer 0,5 M MgCl2 par dissolution de 4,76 g de MgCl 2 dans 100 ml de H 2 O distillée Gardez sur la glace. Enlever le ballon de l'agitateur, et à mesurer la densité optique (DO) à 600 nm en utilisant un spectrophotomètre pour déterminer la densité cellulaire. Calculer le volume de la culture induite nécessaire de telle sorte que chaque échantillon de sphéroplastes a 1 × 10 10 cellules. NOTE: L'approximation d'une DO600 de 1 indique une concentration de 10 9 cellules / ml pour E. coli 24 peut être utilisée. Centrifugeuse le volume calculé de la culture induite dans un tube de 1,5 ml à 12000 × g à température ambiante pendant 5 min. Préparer au moins deux échantillons dans le cas où un problème se pose dans la préparation des échantillons. Retirer le surnageant de la culture centrifugée et remise en suspension chaque culot de cellules dans 100 ul de FB glacée. Centrifugeuse à 12.000 ×g à température ambiante pendant 1 min, puis éliminer le surnageant par pipetage. Remettre en suspension chaque culot dans 350 ul de FB glacé supplémenté avec 3,5 ul de 10 mg / ml de lysozyme. Chaque tube vortex lentement tout en ajoutant goutte à goutte 700 pi d'EDTA 1 mM, et ensuite incuber les tubes à température ambiante pendant 20 minutes tout en faisant tourner lentement sur un dispositif de rotation de tube pour mélanger les échantillons. Enlever les tubes du dispositif de rotation, ajouter 50 ul de glace froid 0,5 M MgCl2 à chaque tube, et on incube sur la glace pendant 10 minutes. Centrifuger les tubes à 11 000 x g à 4 ° C pendant 10 min. Isoler le culot de sphéroplastes. Utilisez un micropipette avec une pointe de 1 ml pour tirer lentement partie du culot. Tout en maintenant le tube à un angle avec l'ouverture directement au-dessus d'un nouveau tube de 1,5 ml, soulevez lentement la pointe de la pipette sur le surnageant et faites glisser la pastille dans le nouveau tube. Si un volume important de surnageant est transféré dans le nouveau tube, retirez-le par pipetage. Si le culot est pas ferme enough pour transférer, re-centrifuger à 11000 × g pendant 2 min et tentative d'isolement de granulés à nouveau. Remettre en suspension le culot de sphéroplastes dans chaque tube 1 ml de glace froid 1 x PBS. Alternez entre pipetage et tourbillonner lentement sur un support de vortex jusqu'à ce que le culot est totalement remis en suspension. Ne pas conserver les échantillons hors de la glace pendant plus de 2 minutes à la fois, et revenir à la glace pendant au moins 5 minutes avant de retirer de la glace à nouveau. Gardez les sphéroplastes à 4 ° C (jusqu'à 2 jours) jusqu'à son utilisation pour le panoramique à l'étape 4. 3. Immobiliser l'antigène cible sur des billes magnétiques Biotinyler l'antigène cible in vivo au cours de la production recombinante dans E. cellules de E. coli. Vous pouvez également utiliser la conjugaison chimique 25 ou antigène cible d'achat qui a déjà été biotinylé et passez à l' étape 3.2. Ajouter 816 g bicine à 50 ml d'eau pour faire 10 × bicine tampon. Diluer le buffer à 1 x H 2 O distillée et de la chaleur à 50 ° C. Ajouter 14,7 mg de biotine pour 12 ml de tampon 1 x bicine chauffé pour former une solution de biotine qui est la biotine 5 mM dans 10 mM de tampon bicine. Conserver à -20 ° C jusqu'à leur utilisation. Et exprimer biotinyler la protéine cible en utilisant le plasmide pAK400cb-BCCP 26, ce qui permet la production de l'antigène cible en tant que fusion de la protéine porteuse de biotine carboxyle (BCCP). NOTE: E. cellules de E. coli natif biotinyler BCCP, ce qui élimine la nécessité de purifier et chimiquement biotinyler la protéine cible avant immobilisation sur des billes revêtues de streptavidine. Le natif E. coli , la biotine – ligase BirA est suffisante pour biotinyler la protéine de fusion. Cultivez E. coli contenant le plasmide de biotinylation (avec l'antigène cible inséré en tant que fusion à l' extrémité N-terminale de la BCCP) O / N pendant 15 à 18 heures dans 5 ml de milieu LB additionné de 20 pg / ml de Cm à 37 ° C tout en agitant à 225 tours par minute. Mesurer la DO à 600 nm en utilisant un spectrophotomètre et calculer le volume de la culture nécessaire (V add) à la sous – culture à une DO de départ de 0,05 à 25 ml de milieu LB frais avec 20 pg / ml cm en utilisant l'équation: V ajouter = (0,05 × 25 ml) / (DO 600 à 0,05), où OD 600 est la densité optique de la culture O / N et V add est le volume de la culture O / N à ajouter à la LB. frais La sous-culture et de croître jusqu'à une DO de 0,5 à 0,8 dans un agitateur mis à incuber à 37 ° C et à 225 tours par minute. Ajouter β-D-thiogalactopyranoside d'isopropyle 1 à une concentration finale de 100 pM et de la biotine à une concentration finale de 5 uM. Induire l'expression dans un agitateur à incuber pendant 15-22 heures à 20 ° C et à 225 tours par minute. Récolte des bactéries par centrifugation à 4000 x g à 4 ° C pendant 10 min. Retirer le surnageant. Conserver le culot à -20 ° C jusqu'à utilisation. Ajouter1 ml d'un détergent de lyse cellulaire par 0,2 g de culot cellulaire. Remettre en suspension par pipetage et faire tourner doucement pendant 20 minutes pour lyser les cellules. Après la lyse, centrifuger à 16 000 x g et 4 ° C pendant 20 min. Pipeter le lysat soluble (surnageant) dans un nouveau tube de 1,5 ml. Utilisez une colonne de poids moléculaire de coupure de 3 kDa pour éliminer la biotine non liée. Pipeter le lysat dans la colonne, et centrifuger à 20 ° C selon les instructions du fabricant. Laver avec du PBS 1 x jusqu'à ce que la biotine dans le lysat a été dilué 100 fois, et le volume du lysat lavé est égal au volume initial du lysat. Transférer le lysat dans un nouveau tube. Immobiliser l'antigène cible biotinylé sur des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Préparer de 1 x PBS et 1 x PBS avec 0,1% (p / v) de BSA comme décrit dans l'étape 2.3.1. Préparer les billes magnétiques. REMARQUE: Ceci nécessite l'utilisation d'une grille de séparation magnétique. Resuspendre streptavidin revêtu des billes magnétiques dans leur flacon d'origine. Soit vortex pendant au moins 30 secondes ou tourner pendant 5 min. Transférer 7 à 10 × 10 9 billes dans un tube de 1,5 ml. REMARQUE: le volume requis dépendra de la concentration de billes fourni par le fabricant. Placer le tube contenant les perles sur le porte-aimant pendant 2 minutes pour collecter les perles sur le côté du tube. Avec le tube toujours sur l'aimant, retirez délicatement le surnageant par pipetage sans perturber les perles. Pour laver, retirer le tube de l'aimant, et remettre en suspension les billes dans 1 ml de 1 x PBS par pipetage sans générer des bulles. Retour le tube à l'aimant pendant 2 minutes pour recueillir les perles, et retirer délicatement le surnageant par pipetage. Répétez le processus deux fois de plus pour un total de trois lavages. Veiller à ce qu'aucun liquide est laissé dans le tube après le lavage final. Ajouter le lysat contenant l'antigène biotinylé au bea magnétiqueds. Retirer le tube de l'aimant et remettre en suspension les billes dans 1 ml de lysat (étape 3.1.5). Incuber à température ambiante pendant 30 minutes tout en faisant tourner doucement. Placer le tube sur l'aimant pendant 3 min pour recueillir les billes revêtues d'antigène. Laver les billes revêtues cinq fois avec 1 x PBS avec 0,1% de BSA de la même manière que celle décrite dans les étapes 3.2.2.3 à 3.2.2.4. Après le lavage final, la remise en suspension des billes dans 1 x PBS avec 0,1% de BSA au même volume utilisé dans l'étape 3.2.2.2. Si l'antigène cible immobilisé est stable à 4 ° C, de stocker les billes revêtues à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire pour un balayage panoramique. Sinon, passez à l'étape 4. 4. Écran de la Bibliothèque scFv par Panning contre l'antigène cible (Figure 4) Figure 4. Panning (étape 4). Antigen-billes magnétiques recouvertes are incubée avec des sphéroplastes exprimant des variants de la bibliothèque d'anticorps. L'ADN plasmidique de sphéroplastes liées aux billes est récupérée et utilisée pour générer une sous-banque qui est criblée en utilisant l'écran secondaire à base d'ELISA. Correspondantes étapes de protocole sont notées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Incuber les billes revêtues avec sphéroplastes. Utiliser un sphéroplastes à perler rapport d'environ 5: 1. Ajouter 4 × 10 9 sphéroplastes et 8 × 10 8 perles dans un tube de 15 ml stérile. NOTE: Supposons que pas de cellules ont été perdus au cours du processus de sphéroplastes, de sorte que la concentration est encore 1 × 10 10 sphéroplastes / ml. Ajouter 1 x PBS avec 0,1% de SAB pour porter le volume total à 4 ml. Aliquoter en quatre tubes de 1,5 ml avec 1 ml chacun. Incuber les réactions à 4 ° C pendant 5 heures tout en tournant doucement. Prepare sphéroplastes liées aux billes pour une réaction en chaîne par polymérase (PCR). Placer les tubes de réaction panning sur l'aimant pendant 3 min. Retirer le surnageant par pipetage, et laver les sphéroplastes liées aux billes quatre fois avec de la glace froide 1 × PBS avec 0,1% de BSA de la même manière que celle décrite dans les étapes 3.2.2.3 à 3.2.2.4. Resuspendre les sphéroplastes liées aux billes dans chaque tube dans 25 pi d'eau distillée 2 O. Stocker les perles à -20 ° C ou passez à l'étape 4.3. Effectuer l'ensemble du plasmide PCR sur sphéroplastes liées aux billes pour amplifier les plasmides contenant les gènes de scFv liées aux billes. Obtenir des amorces avec les séquences suivantes: 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3 '(amorce directe) et 5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3' (amorce inverse). NOTE: Ce sera lier bout à bout sur des brins opposés du plasmide pimd (figure 2) et sont conçus pour recuire à une caractéristique commune de pimd, donc l' amplification se produit quel que soit levariante séquence scFv. Phosphoryler les amorces. Remarque: l'absence de phosphorylation, re-ligature ne se produit. Les amorces peuvent également être commandés avec 5'-phosphorylation, plutôt que d'utiliser cette méthode de phosphorylation dans ce protocole. Dans un tube de 0,5 ml, mettre en place une réaction de phosphorylation pour l'amorce de PCR vers l' avant décrite dans le tableau 1. Répétez ce processus pour l'amorce inverse. Incuber les réactions à 37 ° C pendant 1 heure. Puis incuber à 65 ° C pendant 20 minutes pour désactiver le polynucleotide T4 kinase (PNK). Stocker les amorces phosphorylées à -20 ° C. Effectuer PCR. Dans un tube de PCR, préparer la réaction de PCR telle que décrite dans le tableau 2. NOTE: Les réactions multiples peuvent être préparés pour un rendement plus élevé. Les sphéroplastes liées aux billes non utilisés peuvent être conservés à -20 ° C. Chauffer les réactions de PCR à 98 ° C pendant 15 minutes dans un cycleur thermique pour assurer la pleine lyse des sphéroplastes. Retirer les tubes du cycleur thermique, et d'ajouter 0,5 ul d'une polymerase haute fidélité à chacun. Tubes Retour au cycleur thermique et exécuter en utilisant le programme détaillé dans le tableau 3. Réunir les produits de PCR, le cas échéant. Conserver à -20 ° C ou passez à l'étape 4.4. Tableau 1. PNK réaction de phosphorylation (étape 4.3.2.1). Réactif Volume (ul) H2O distillée 15 un tampon de réaction de ligase T4 ADN 10x 2 100 pM amorce 2 T4 Polynucleotide kinase (PNK) 1 ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-with-next.within page =" always "> Tableau 2. réaction PCR entier plasmide (étape 4.3.3.1). Réactif Volume (ul) H2O distillée 28,5 tampon 5x haute fidélité de la polymérase dix amorce sens 10 uM phosphorylée 2.5 amorce antisens 10 uM phosphorylée 2.5 40 mM dNTP mix (10 mM de chaque dNTP) 1 sphéroplastes de perles assorties 5 Programme Tableau 3. PCR (étape 4.3.3.2). <tbody> Étape Température (° C) Temps (min: sec) Nombre de cycles denature initiale 98 00h30 1 Dénaturer 98 00h10 35 recuit 69 00h30 Extension 72 0:30 par kb L'extension finale 72 06h00 1 Tenir 12 Infini 1 Re-circulariser les produits entiers plasmidique PCR, et utiliser le produit ligaturé pour transformer MC4100 E. cellules de E. coli. On purifie le produit PCR en exécutant la réaction de PCR sur un gel d'agarose à 23, la coloration de l'ADN dans le gel 23, et en utilisant unkit de nettoyage de gel pour purifier le plasmide linéarisé en suivant les instructions fournies par le fabricant. Mesurer la concentration à l'aide d'un spectrophotomètre à 260 nm. Stocker le fragment purifié à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire, ou passez à l'étape 4.4.2. Re-circulariser le plasmide à partir du produit de PCR. Pour empêcher la ligature intermoléculaire du produit de PCR, effectuer la réaction de ligature avec une faible concentration 27 de 1 ng / pl de produit PCR. Calculer le volume nécessaire pour la préparation d'une réaction de ligature 800 ul à cette concentration. Préparer la réaction de ligature sur la glace. Dans un tube, ajouter le volume calculé à l' étape 4.4.2.1 du produit de PCR, 80 ul de tampon de ligase 10X de l' ADN et H2O distillée jusqu'à 800 ul. Ajouter 4 ul d'ADN ligase de T4, et placer immédiatement les tubes à 16 ° C dans un bain d'eau ou thermocycleur. Incuber à 16 ° CO / N pour 14 à 18 ans h. Stocker les réactions de ligature terminé à -20 ° Cjusqu'à ce que nécessaire, ou passer à l'étape 4.4.3. Placer la réaction de ligature sur un bloc chauffant à 65 ° C pendant 15 min à la chaleur inactiver l'ADN ligase. Ensuite, utilisez un kit de membrane de microdialyse ou de l'ADN de nettoyage pour dessaler l'ADN ligaturé. Conserver à 20 ° C ou passez à l'étape 4.4.4. Utilisez le, produit toute inactivé à la chaleur de-salé ligature pour transformer MC4100 E. 23 cellules de E. coli. Préparer les stocks de glycérol, tel que décrit à l'étape 1.3, des cellules contenant le sous-banque batée résultant, et aliquotes stocker à -80 ° C. Répétez l'étape 4 dans son intégralité à l'aide d'une aliquote de l'étape 4.4.4 pour faire une deuxième panoramique sur la sous-banque. REMARQUE: Un deuxième panoramique permet d' enrichir pour les constituants de bibliothèque qui se lient bien à l'antigène cible 19. 5. Effectuer un écran secondaire à l'aide d'un dosage immunoenzymatique Méthode enzymatique liée à l'identification des clones prometteurs pour une caractérisation (Figure 5) </P> Dépistage ELISA de Figure 5. secondaire (étape 5). Variantes (A) de la bibliothèque de la sous – bibliothèque enrichie pendant le panoramique sont inoculées dans des puits individuels d'une plaque de culture pour la croissance et l' expression. (B) Une plaque ELISA revêtue d' un antigène cible. (C) Les variantes de la bibliothèque sont criblées en utilisant l'écran secondaire à base d'ELISA décrit dans le protocole. Lors de l'analyse des données obtenues à partir de l'écran secondaire, des variantes d'intérêt sont sélectionnés et caractérisés davantage. Correspondantes étapes de protocole sont notées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Décongeler un tube de la sous-banque batée (de l'étape 4.4.4) et de la plaque sur des plaques d'agar LB. Plate plusieurs dilutionsà des concentrations suffisamment faibles pour assurer des colonies individuelles (par exemple, 10 2 – 10 6 dilutions -fold). Incuber les plaques pendant 15 à 18 heures à 37 ° C. Stocker les plaques à 4 ° C ou passez à l'étape 5.2. Culture et induire des colonies de la sous-banque batée. Effectuer toutes les étapes dans des conditions stériles. Utilisez une pipette multicanaux pour les étapes impliquant des plaques à 96 puits. Ajouter 200 pi de LB avec 20 ug / ml cm dans chaque puits d'une plaque à 96 puits de culture à fond rond. Choisissez une colonie individuelle de la plaque de gélose avec une pointe de pipette, placer la pointe dans le premier puits de la plaque de 96 puits, et remuer doucement pour inoculer. Utiliser un nouvel embout pour chaque puits. Inoculer une colonie dans chaque puits. En tant que témoin, comprennent au moins un contrôle de stérilité bien avec aucune colonie inoculées. Répétez les étapes 5.2.1 et 5.2.2 pour inoculer plusieurs plaques à 96 puits. Placer les plaques à 96 puits sur un agitateur de microplaque à 310 tours par minute. Incuber à 376; C pendant 20 à 24 heures pour exprimer les scFv. Pour chaque plaque de culture préparé à l'étape 5.2, manteau une plaque à 96 puits ELISA avec l'antigène cible. Diluer l' antigène cible purifié à une concentration appropriée (par exemple, 1 pg / ml à 4 mg / ml) dans 1 x PBS pour rendre la solution de revêtement. Faire 5 ml d'une solution de revêtement pour chaque plaque à 96 puits. NOTE: La concentration appropriée dépend de l'antigène spécifique utilisé et peut être nécessaire d'ajuster. Ajouter 50 ul de la solution de revêtement pour chaque puits d'une plaque de polystyrène clair 96 puits à haute liaison ELISA. Tapoter doucement la plaque sur la surface de la paillasse pour assurer que toute la surface de chaque puits est revêtue. Répétez l'opération pour chaque plaque. Incuber les plaques à 4 ° CO / N. Répliquer les colonies provenant des plaques de culture à 96 puits sur des plaques d'agar-agar. Placez un polystyrène réplicateur stérile dans les puits d'une plaque de culture pour recueillir une petite quantité de savon mouid. Soulevez avec précaution le réplicateur et le transfert à une plaque de gélose LB 15 cm de telle sorte que tous les conseils sont en contact avec la plaque. Une fois que le liquide a transféré, soulevez le réplicateur directement vers le haut. Répétez l'opération pour chaque plaque de culture. Étiquette de la plaque de gélose avec l'orientation correcte de sorte que les résultats de l'écran secondaire dans la plaque de 96 puits peuvent être jumelés à la colonie répliquée correcte sur la plaque, si une caractérisation plus poussée est souhaitée. Cultivez à 37 ° C pendant 15 à 18 heures, puis stocker à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Effectuer l'écran secondaire ELISA. Préparer la solution de blocage en faisant 2% (p / v) de lait en poudre dans 1 x PBS. Vider la solution de revêtement des plaques ELISA. Ajouter 100 ul de la solution de blocage dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant au moins 2 heures, ou le bloc O / N à 4 ° C. Préparer le tampon de lavage en ajoutant le polysorbate 20 à une concentration finale de 0,05% dans 1 x PBS. Faire 250 ml par plaque ELISA. Ajouter 20 ul d'uneconcentré détergent lyse cellulaire à chaque puits de la plaque de culture à fond rond et incuber la plaque de culture sur un agitateur de microplaque à température ambiante pendant 15 à 20 min. Commencer la lyse en même temps que le blocage des plaques ELISA est terminée de sorte que la lyse et le lavage à l'étape 5.5.4 peuvent être effectuées simultanément. Vider la solution de blocage des plaques ELISA. Laver les plaques ELISA bloqués quatre fois avec 200 pi de tampon de lavage par puits par lavage. Vider le tampon de lavage dans les puits. Transfert de 50 pi de chaque puits de la plaque de lyse cellulaire au puits correspondant de la plaque ELISA, en utilisant une nouvelle astuce pour chaque puits. Incuber la plaque ELISA à température ambiante pendant 1 ou 2 heures. Préparer la solution d'anticorps pour détecter les scFv liés. Utiliser une peroxydase de raifort (HRP) conjugué à un anticorps primaire qui se lie au marqueur épitopique FLAG fusionné au scFv de la bibliothèque. Diluer l'anticorps à la dilution appropriée à utiliser dans un test ELISA (voir le fournisseur & #39; s recommandations) à 2% (p / v) de lait sec dans 0,05% de polysorbate 20 dans 1 x PBS. Préparer 5 ml pour chaque plaque. Laver les plaques ELISA quatre fois avec le tampon de lavage tel que décrit à l'étape 5.5.4. Ajouter 50 ul de la solution d'anticorps dans chaque puits de la plaque ELISA. Incuber pendant 2 heures à 1 à la température ambiante. Préparer le substrat HRP en dissolvant o phénylènediamine dichlorhydrate (OPD) comprimés dans H 2 O distillée selon le protocole du fabricant tout en évitant la lumière. Préparer 20 ml par plaque ELISA. Préparer 3 MH 2 SO 4 par dilution de H 2 SO 4 concentré avec H2O distillée, si nécessaire. Préparer 5 ml par plaque ELISA. Attention: H 2 SO 4 est un acide fort. Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle approprié. Laver les plaques ELISA à quatre reprises avec du tampon de lavage, comme décrit dans l'étape 5.5.4. Incuber les plaques ELISA avec le SUBSTRA HRPte. Ajouter 200 pi de substrat de HRP dans chaque puits. Pour réduire au minimum l'exposition lumineuse, ajouter le substrat à une plaque ELISA à la fois, et l'envelopper de papier d'aluminium avant de passer à la plaque suivante. Incuber les plaques pendant 30 à 60 min à température ambiante dans l'obscurité. Après les 30 premières minutes, vérifier les plaques d'assombrissement du substrat, et incuber plus si nécessaire pour visualiser le développement de la couleur. Ajouter 50 ul de 3 MH 2 SO 4 à chaque puits pour arrêter la réaction. En utilisant une pointe différente pour chaque puits, mélanger la solution dans les puits par pipetage de haut en bas, sans faire mousser. Par souci de cohérence et d'éviter la saturation, ajouter le H 2 SO 4 rapidement et soigneusement à l' ensemble des plaques ELISA avant de mélanger la solution pour chaque plaque. Mesurer l'absorbance de la solution dans les puits de chaque plaque à 492 nm en utilisant un lecteur de plaque. Analyser les données d'absorbance pour identifier scFv variantes que exhibil promet des signaux de liaison et de caractériser ces scFv prometteurs. Sélectionnez scFv qui présentent des signaux d'absorbance plus élevées que le signal de fond et plus élevé que le signal moyen sur chaque plaque. NOTE: Le niveau d'absorption dépendra des propriétés de l'antigène et de l'anticorps anti-FLAG utilisés, ainsi que la force des variantes scFv qui ont été isolées dans le criblage.