Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Bioactieve kleine moleculen fundamenteel werkt door interactie met de functie van één of meer "target" moleculen, meestal proteïnen veranderen, in de cel. In drug discovery, wanneer een werkzame verbinding wordt ontdekt door fenotypische screening, identificatie van de moleculaire target (s) van die verbinding is essentieel, niet alleen voor het begrijpen van het werkingsmechanisme en de mogelijke bijwerkingen van de verbinding, maar ook potentieel ontdekken nieuwe biologie ten grondslag liggen aan de ziekte model en de weg effenen voor de ontwikkeling van nieuwe mechanistische klasse van therapeutische middelen ^1. Hoewel target identificatie is niet vereist voor een geneesmiddel om therapeutisch worden gebruikt, in de afgelopen jaren is er een toenemende erkenning dat nieuwe kandidaat-geneesmiddelen hebben meer kans om te slagen in klinische studies, en dus geven een beter rendement op de investering, als een gevalideerde doelwit is bekend ^2. Er is dus een groeiende interesse in werkwijzen voor het identificeren van kleine geweestmolecule doeleiwitten.

Een klassieke doel identificatieexperiment vertrouwt typisch op affiniteitszuivering, waarbij het ​​kleine molecuul van belang wordt geïmmobiliseerd op een hars en geïncubeerd met lysaten van gehele cellen, waarna ongebonden eiwitten weg gewassen en de resterende eiwitten worden geëlueerd en geïdentificeerd ^3. Hoewel deze techniek is gebruikt om de doelstellingen van vele kleine moleculen identificeren ^4, is ongeschikt als een universele prisma ID methode om verschillende redenen. Ten eerste moet het doeleiwit de natieve conformatie na cellyse om zijn vermogen te binden aan de kleine molecule behouden blijven. Dit kan bijzonder problematisch voor membraaneiwitten, die vaak conformatieveranderingen ondergaan na hun natieve omgeving verwijderd of gewoon aggregaat en neerslaan uit oplossing. Ten tweede moet het kleine molecuul chemisch worden gemodificeerd zodanig dat deze kan worden geïmmobiliseerd op de hars behoudhet vermogen om het doeleiwit binden. Diepe bindingsholtes kan dus niet toegankelijk voor een klein molecuul zodra het is bevestigd aan de hars. Ten derde moet de bindingsaffiniteit voldoende hoog zijn dat de interactie wordt gehandhaafd tijdens de wasstappen, waardoor identificatie van lagere affiniteit interacties uitdaging. Ten vierde, omgevingsfactoren zoals pH, ionconcentratie of de aanwezigheid van andere endogene moleculen ruimtelijk variëren binnen de cel en soms voorwaarden geneesmiddelresistente targetinteracties. Aldus vinden van de juiste voorwaarden te scheppen en handhaven binding buiten de cel kan een aanzienlijke hoeveelheid trial and error vereist.

Fotoaffiniteitslabeling omzeilt deze problemen doordat de covalente binding van een klein molecuul en het doel binnen de context van een natieve cel. In plaats van het immobiliseren van het kleine molecuul een grote volumineuze hars, wordt het molecuul in plaats chemisch gemodificeerd om twee kleine functionele g installerenroups: een fotoactiveerbare groep die covalente verknoping mogelijk maakt om het doeleiwit bij bestraling met een bepaalde golflengte van licht, en een reporter groep waarmee het doeleiwit te detecteren en vervolgens geïsoleerd. Levende cellen worden behandeld met de affiniteit probe bindt de probe en covalent verknoopt aan het doeleiwit en het probe-eiwitcomplex wordt vervolgens geïsoleerd intact. De specificiteit van de probe binden aan het doelwit wordt aangetoond door het uitvoeren van een competitie experiment in parallel, waarbij een overmaat van de moederverbinding wordt gebruikt om te concurreren weg binding van de probe aan het doelwit eiwit.

Het ontwerp en de synthese van affiniteit probes varieert sterk van de ene klein molecuul naar de andere, en zal niet worden behandeld in dit protocol; hebben echter een aantal uitstekende discussies over het onderwerp gepubliceerd ^5-9. De belangrijkste overweging is dat de sonde blijft de biologische activiteit van de moederverbinding derhalve presumably binding aan hetzelfde doel (en). Structuur-activiteitsrelaties (SAR) studies moeten worden uitgevoerd om te bepalen welke delen van het molecuul kan worden gewijzigd zonder verlies van bioactiviteit. Een verscheidenheid van verschillende chemische groepen zijn gebruikt als fotoactiveerbare crosslinkers, zoals diazirine, benzofenon, azide en aryl, die elk voor- en nadelen ^10. Ook zijn er meerdere reporter labels die zijn gebruikt om probe bindende eiwitten te isoleren. Reportergroepen kunnen functioneel op zichzelf, zoals de algemeen gebruikte biotine of fluorescente labels, of kan precursors dat verdere functionalisering na de fotoverknoping stap, die het voordeel dat kleinere en dus minder gemakkelijk bioactiviteit ¹¹ compromis vereisen.

In dit protocol, hebben we een affiniteit probe die een diazirine fotoverknoping groep, en een terminale alkyn voor de bevestiging van een reporter-groep door een Cu (I) gebruikte -catalyzed azide-Acetyleenalkoholen Sharpless-Huisgen cycloadditie (of klik) reactie ^12-15. De SAR studies probe ontwerp en synthese, en de resultaten van deze onderzoeken zijn elders gepubliceerd ^16-18.