Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
מלבד גנום הגרעין, בכל תא האיקריוטים גם מכיל אלף עותקים של דנ"א מעגלית קטנה במטריצה המיטוכונדריה. בעוד ה- DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA) מקודד יחידות משנה חיוניות של שרשרת העברת אלקטרונים, הרוב של proteome המיטוכונדריה, כולל כל הגורמים שכפולים שעתוק של mtDNA מקודד על ידי הגנום הגרעיני. בניגוד הגנום הגרעיני העוקב לחוקי מנדל ירושה, הגנום המיטוכונדרי החיה עובר בירושה באופן בלעדי דרך השושלת האימהית. לכן, ההבנה כיצד mtDNA הוא התרבו מדור אחד למשנהו דרך ביצית האישה חשוב ביסודו. עם זאת, יש המשך דיון בשאלה כיצד שכפול mtDNA מוסדר germline הנשי. בנוסף, התיאוריה צוואר הבקבוק mtDNA מקובל לשידור mtDNA עולה כי אוכלוסיית mtDNA בתאי הנבט בראשיתי הוא subsampled למספר קטן יחסית דוריןפיתוח גרם 1 2. זה גם מרמז כי שכפול mtDNA הוא זמני ומוסדר מרחבית במהלך oogenesis. לפיכך, גילוי באתרו של שכפול mtDNA במהלך ההתפתחות germline יקל על הבנת המנגנון של ירושה mtDNA.
תסיסנית oogenesis מספק מערכת צייתן גנטית ללמוד שכפול mtDNA ושידור. בכל אחד משתי השחלות תסיסנית, יש 16-20 מחרוזות עצמאיות של תאי ביצה בשם ovarioles 3, שהן היחידות התפקודיות של ייצור ביצים (ראה איור 1 א). כל ovariole מכיל ארגון ליניארי מתקדם של oogenesis, שם הקצה הקדמי מורכב מבנה הנקרא germarium. Germarium הוא חולק לארבעה אזורים המכילים תאי נבט בשלבים התפתחותיים שונים. באזור 1, תאי גזע germline לעבור חלוקה סימטרית לייצר תאי בת המכונים גystoblasts. 2a האזור המכיל את cystoblasts שסיים החלוקה הסופית שלהם. Cystoblasts לעבור ארבעה סיבובים של חלוקה לייצר קבוצות 16 תאים. 16 התאים נשארים מחוברים זה לזה בגשרים ציטופלסמית שנקראים תעלות טבעת. רק באחד התאים מתחייב בידול כמו הביצית, ואילו 15 אחרים לפתח כתאי אחות polyploid. מבנה ציטופלסמית חיוני, המכונה fusome, מוצע להקל עם הקמתה של תעלות טבעת, לקבוע את קוטביות ציסטה ואחות אינטראקציות תא-ביצית 4,5. כמו ציסטות לנוע לעבר 2b באזור, המבנים ציסטה בדיוק לרוחבה כולו של germarium, ולהפוך להיות מזוהה יותר עם תאי זקיק. מבני germarium מסתיימים באזור 3 המכיל את תא ביצת הניצנים הראשון. בהמשך לכך, תאי הביצה הם התאספו בקצה האחורי של germarium, אשר התקדמותך ovariole ב 14 שלבים ברורים מורפולוגית. הגידול של ביצית תלוי תאי האחות, WHחלבונים תחבורה ich, mRNA ומבנים endomembrane (למשל, Golgi) דרך תעלות הטבעת לתוך הביצית. במהלך תסיסנית oogenesis, נמצא כי חלק מן המיטוכונדריה בתוך כל ציסטה 16 תאים היו קשורים עם fusome, עבר דרך תעלות הטבעת נמסרו לביצית אחת מסה גדולה בשם Balbiani הגוף 6. תופעה זו הוצעה לתרום בקרת האיכות של ירושת המיטוכונדריה דרך שחלות נשיות.
איתור של סינתזה mtDNA מסתמך על שילוב של מבשרי DNA שכותרתו לתוך ה- DNA התאי. באופן מסורתי, אנלוגי nucleoside של thymidine 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) שימש לתייג את שכפול mtDNA בתאים בתרבית רקמה 7,8. עם זאת, תיוג BrdU מבוסס הנוגדנים מפגין מספר מגבלות, בעיקר עבור מכתים רקמות כל ההר. חסרון עיקרי אחד תיוג BrdU הוא שהיא דורשת denaturation DNA לחשוףאת epitope BrdU, כך ניתן לאתר אותו על ידי נוגדן אנטי BrdU. הדגימה צריכה להיות מטופלים בתנאי denaturing קשים כגון כימיקלים (למשל, חומצה הידרוכלורית או תערובות של מתנול וחומצה אצטית), חום, או עיכול עם DNase, אשר יכול לשבש את המבנה של הדגימה ו לסבך את ההליך המכתים הבא 9, 10.
הנה, אלטרנטיבה thymidine אנלוגי 5 ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) משמש לתייג את הדנ"א המיטוכונדרי שכפול השחלות מבוגר תסיסנית. שיטה זו היא מהירה מאוד רגיש. Edu הוא לשלב בקלות לתוך ה- DNA הסלולר במהלך שכפול הדנ"א. הגילוי הבא מבוסס על תגובת "לחץ", Cu (I) -catalyzed התגובה קוולנטיים בין קבוצת מסוף אלקין וכן אזיד פלורסנט 10. בגלל התגובה אינה מחייבת את denaturation של הדגימה, היא מאפשרת שימור מבני טוב. יתר על כן, בגודל של צבעzide הוא רק 1/500 מזו של מולקולת נוגדן 10, המאפשר חדירה מהיר ויעיל של רקמות כל הר. השתמשנו בשיטה זו כדי לזהות שכפול mtDNA במהלך oogenesis תסיסנית ומוצא דפוס מרחבית מרשים באזור germarium של שחלה תסיסנית 11, דבר שמוביל אותנו להציע מנגנון ירושה סלקטיבית שכפול תלויה mtDNA. אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט על תיוג edu של שכפול mtDNA בשחלות תסיסנית. כדי להדגים את היישום של הפרוטוקול, גם בדקנו את שכפול mtDNA בתוך תסיסנית מוטציה mtDNA (mt: T300I COI) 11, וכן עם טיפול מגוונות של uncouplers המיטוכונדריה, אשר להפיג את קרום המיטוכונדריה פוטנציאל ואפשרות לשבש שכפול mtDNA.
תיוג EDU הוא שיטה חדשה ויעילה לגילוי סינתזה של DNA בתאים מתרבים, אשר מבוססת על שילוב וצביעת אנלוגים nucleoside בדנ"א מסונתז החדש. שיטה זו עדיפה על שיטת תיוג BrdU ב שזה מהר מאוד רגיש. יתרה מכך, היא מאפשרת שימור מבני טוב וחדירת EDU-צבען יעיל של כל הר רקמות 9, 10. מבחינה הסטורית, כחלופה עדיפה על תיוג BrdU, תיוג edu שמש ללימוד שכפול הדנ"א גרעיני במהלך S-השלב של מחזור התא. Aphidicolin הוא מעכב של α DNA פולימרז, המהווה את פולימראז העיקרית שכפול הדנ"א הגרעיני S-שלב 12 15. שכפול mtDNA מתבצע על ידי γ DNA פולימרז, שאינו רגיש aphidicolin טיפול. לפיכך, טיפול עם aphidicolin לפני ובמהלך דגירת edu בלמה באופן משמעותי התאגדות edu לתוך ה- DNA הגרעיני. זה אמורלציין כי aphidicolin עשוי להיות יציב במשך כמה שבועות אם מאוחסן כראוי, ואת היעילות של aphidicolin בבלימת שכפול הדנ"א גרעיני הייתה משתנית בידינו. Ovarioles או תאי ביצה עם תיוג DNA הגרעיני החזק צריך להיות מחוץ נתונים נוספים מנתח.
שכפול mtDNA ניתן דמיינו בקלות כמו puncta בציטופלסמה, מקנה גם דרך פשוטה לכמת את רמת שכפול mtDNA ידי ספירת מספר puncta edu, מנורמל את הנפח הכולל של הציטופלסמה. ניתן ליישם תוכנת הדמיה לזהות edu puncta אוטומטית תמונות מיקרוסקופיות, וזה שימושי במיוחד עבור ניתוחים חישובית של ערכות נתונים גדולות. עם זאת, יש לנקוט אמצעי זהירות, כי העיכוב השלם של שכפול ה- DNA הגרעיני יכול להוביל שילוב edu ב לוקוסים ברורים על כרומוזום ולהציג כמו puncta בתוך הגרעין. גם במקרים אחרים, עוצמת edu שילובם repliCating mtDNA יכול להיות חלש, בעוד הרקע והרעש יכולים להיות גבוהים. לכן, הפרמטרים הבודדים עבור ניתוחי תמונה אוטומטיים צריכים להיות מוגדרים היטב. מומלץ גם כי תמונות יש לבחון בעיניים מאומנות לוודא כי puncta הראוי edu מזוהה.
ויזואליזציה של mtDNA החדש המסונתז במהלך תסיסנית oogenesis מספקת הזדמנות לחקור כיצד שכפול mtDNA מוסדר בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים, על ידי ביצוע הניסוי בזבובי נתון למגוון של הפרעות תרופתיות או גנטיות. במחקר קודם, assay ההתאגדות edu בוצעה בתוך הר תסיסנית מוטציה mtDNA: COI T300I 11. יתר על כן, לשבש את פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, השחלות טופלו בריכוזים שונים של FCCP uncoupler המיטוכונדריה או 2,4-dinitrophenol (DNP) לפני edu ההתאגדות. בהתאם למטרות ניסוייםומאפייני סמים, עשויים להיות מאומצות שיטות שונות עבור משלוח יעיל. עבור זבובים בוגרים, ניתן להציג תרופות כמו אדי (למשל, אתנול וקוקאין) 16,17 או תרופות ניתן להזריק לתוך הבטן, שם הוא מתמוסס במהירות בכל הגוף 18. הנוהג הנפוץ ביותר הוא שהתרופות מתווספות האוכל לטוס או נייר סינון סוכרוז / סמים רוויים. לדוגמא, המעכב של הרכבת microtubule, קולכיצין, היה נמאס זבובים במשך 2-3 ימים לפני לנתיחת שחלת 19. לפיכך, חשוב להעריך את שיטת משלוח סמים ולבחור ריכוזים מתאימים.
כדי להבטיח את ההדמיה המוצלחת של שכפול mtDNA בשחלות תסיסנית, מספר שלבים קריטיים חייבות להתבצע בזהירות. בראש ובראשונה, תוך שמירה על כדאיות ובריאות של השחלות במהלך דיסקציה ההתאגדות edu חיוני (שלבים 1 ו -2). המדיום תסיסנית של שניידר עם FBS צריך להיות מחומם ל RTלפני השימוש. אחד צריך לצמצם מגע ישיר בין תאי הביצה והכלים לנתח או טיפים פיפטה. השחלות צריכות להיות שקועות מתחת פתרונות בכל העת כדי למנוע התייבשות. טיפול לא נכון הרקמות יכולות להוביל להתעלף או לא אותות ניאון בקלות. במהלך שלב הרכבת הרקמות, יש להפריד ovarioles אחד מהשני והפרש בשקופית מיקרוסקופ. ודא תאי הביצה אינם מוערמים על גבי אחד את השני. שמנו לב כי תאי הביצה מעבר לשלב 14 מוצגים מעט התאגדות edu. בנוסף, בגלל הגודל הגדול, תאי הביצה בשלב מאוחר לעתים קרובות לגרום לתאי ביצת הצעיר השכנים להיות מחוץ לפוקוס. לכן מומלץ כי תאי ביצה בשלב מאוחר להיות מושלכים.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט תיוג משכפלים mtDNA בשחלות מבוגר תסיסנית. שיטה זו מאפשרת כימות פשוטה של שכפול mtDNA תחת הפרעות גנטיות תרופתיות שונות,ויהיה שימושי עבור לנתח מנגנוני biogenesis התפתחותי המיטוכונדריה וירושת mtDNA.
The authors have nothing to disclose.
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
FCCP | Sigma | C2920 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
BSA | Sigma | A7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |