Summary

Progettazione e l'uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

Published: September 27, 2016
doi:

Summary

We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

Abstract

Descriviamo un basso costo, morbidostat configurabile per caratterizzare il percorso evolutivo della resistenza agli antibiotici. Il morbidostat è un dispositivo di coltura batterica che controlla continuamente la crescita batterica e regola dinamicamente la concentrazione di farmaco di sfidare costantemente i batteri si evolvono per acquisire resistenza ai farmaci. Il dispositivo è dotato di un volume di lavoro di ~ 10 ml ed è completamente automatizzato e dotato di misura della densità ottica e micro-pompe per medio e la somministrazione di farmaci. Per convalidare la piattaforma, abbiamo misurato l'acquisizione graduale della resistenza trimetoprim in Escherichia coli MG 1655, e integrato il dispositivo con una piattaforma microfluidica multiplex per indagare la morfologia cellulare e sensibilità agli antibiotici. L'approccio può essere up-scalata a studi di laboratorio di resistenza ai farmaci antibiotici, ed è estendibile a adattivo evoluzione per i miglioramenti di deformazione in ingegneria metabolica e altri esperimenti di coltura batterica.

Introduction

Dal momento che l'introduzione del primo penicillina antibiotico, microbica resistenza agli antibiotici è trasformata in un problema di salute globale 1. Sebbene l'acquisizione di resistenza agli antibiotici può essere studiato retrospettivamente in vivo, le condizioni di questi esperimenti sono spesso non controllati durante l'intera evoluzione 2. In alternativa, adaptive evoluzione di laboratorio può rivelare l'evoluzione molecolare di una specie microbiche sotto stress ambientali o pressione selettiva da un farmaco antibiotico 3. Recentemente, molti esperimenti evolutivi ben controllati di resistenza ai farmaci antibiotici hanno chiarito la comparsa di resistenza ai farmaci antibiotici. Ad esempio, il gruppo di Austin ha dimostrato rapido emergere in un microfluidica correttamente progettato ambiente compartimenti 4. Il morbidostat recentemente sviluppato induce mutazioni sistematiche sotto farmaco pressione selettiva 5,6. Il morbidostat, un Selec microbicaDispositivo zione che regola continuamente la concentrazione di antibiotico per mantenere una popolazione quasi costante, è un importante progresso dal test di fluttuazione utilizzato in microbiologia 7,8. Nel test di fluttuazione, un antibiotico viene iniettato ad alta concentrazione, ei mutanti sopravvissuti sono schermate e contati. Invece, i microbi in un morbidostat sono costantemente in discussione e acquisiscono mutazioni multiple.

Il morbidostat funziona in modo simile al chemostat, un dispositivo di cultura inventato da Novick e Szliard nel 1950 che mantiene una popolazione costante fornendo continuamente nutrienti mentre diluendo la popolazione microbica 9. Fin dalla sua introduzione, il chemostat è stata avanzata e migliorata. Attuali chemostati microfluidica hanno raggiunto capacità nanolitri e unicellulari. Tuttavia, questi dispositivi non sono adatti per esperimenti evoluzione adattativa, che richiedono una grande popolazione di cellule con molti eventi mutazione 10,11. Recentemente, mini-chemostati con volumi di lavoro del ~ 10 ml sono stati sviluppati per colmare il divario tra bioreattori scala litri e la microfluidica chemostat 12,13.

Qui vi presentiamo la progettazione e l'utilizzo di un basso costo, morbidostat automatizzato per uno studio della resistenza ai farmaci antibiotici. Il modulo proposto può essere impiegato in un incubatore shaker in un laboratorio di microbiologia con requisiti hardware minimi. Il firmware open-source è anche facilmente su misura per applicazioni specifiche di evoluzione adattativa, come l'ingegneria metabolica 3. Infine, il morbidostat è integrato in una piattaforma microfluidica multiplato per i test di suscettibilità antibiotica 14.

Protocol

1. Montaggio e Pretesting del dispositivo Morbidostat Assemblea della Morbidostat Punzone 3 fori sul tappo del flacone di coltura con una siringa 18 G. Tagliare tre pezzi di tubo di polietilene ~ 7 cm di lunghezza. Inserire questi tre pezzi di tubo di polietilene sul tappo. Utilizzare nastro per avvolgere il bordo della calotta per servire come il cast per la miscela polidimetilsilossano (PDMS). Miscelare 5 g di un componente e 0,5 g di componente B dei PDMS in un contenitore di plastica 15…

Representative Results

Il morbidostat sopra descritto è schematizzato in Figura 1. Le operazioni morbidostat comuni, tra evoluzione sperimentale, test di sensibilità agli antibiotici e controllo della morfologia cellulare, sono stati convalidati in E. cultura coli MG1655 esposti a trimetoprim (TMP), un antibiotico comunemente usato 5,6. TMP induce molto particolari graduali aumenti di resistenza ai farmaci, e le mutazioni sono raggruppati intorno al gene diidrofo…

Discussion

Un dispositivo morbidostat a basso impatto da componenti a basso costo è dimostrata. Gli aumenti di livello resistenza ai farmaci registrati dal dispositivo sono coerenti con quelli di precedenti rapporti di 5. Progettato per gli studi evolutivi di resistenza ai farmaci, il dispositivo è potenzialmente applicabile a molti altri esperimenti. In primo luogo, un database completo di mutazioni indotte da farmaci può essere stabilita per un ampio insieme di antibiotici clinicamente rilevanti. Ad esempio, il per…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.

Materials

Environmental Shaker Incubator BioSan ES-20
Arduino Leonardo board Arduino Leonardo
680 Ohm Carbon Resistor Digikey Bias resistor for LED
100k Ohm Carbon resistor Digikey Bias resistor for phototransistor
940 nm light emitting diode Bright LED Electronic BIR-BM13E4G-2 Optical density measurement
940 nm phototransistor Kodenshi  ST-2L2B Optical density measurement
Darlington pair IC Toshiba Mouser ULN2803APG  this IC drives micropumps and magnetic stirring unit
5V DC brushless fan  ADDA AD0405LX-G70 spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com
Piezoelectric micropump CurieJet PS15I-FT-5L Pressure >3kPa  Flow rate >5 ml/min
Tygon 3350 Tuning Saint Gobain ABW00001 ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' 
Magnetic Stir bar COWIE tapered shape dim: 10 mm x 4mm
Glass scintillation 20ml vial DGS Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h)
Culture vial holder Custom made from Polyformaldehyde 
Silicone  Dow Corning Sylgald 184 used to seal the glass vial
Medium bottle VWR 66022-065
Difco M9 minimal salt 5x BD Medium
Cadamino Acid BD Medium
glucose Sigma
Agar Bateriological Oxoid for agar plate
Luria Bertani medium
Inverted microscope Leica Microsystems Leica DMI-LED used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55
Microscope Incubator Live Cell Instrument CU-109 used for microfluidic measurement
Solenoidal valves Pneumadyne S10MM-31-12-3 Normally open 1.3 Watt 12 Vdc
USB interface card Hobby Engineering USBIO24-R Digital I/O Module  for microfluidics measurement
Air compressor Rocker Scientific ROCKER 440 Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi
Male luer-lock fittings to 1/8" barb ValuePlastics.com MTLL230-1 used for microfluidic control
1/8" barb to 10-32 threaded port ValuePlastics.com B-1 used for microfluidic control
Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port ValuePlastics.com KFTL-1 used for microfluidic control
NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) DigiKey.com 2N6427GOS-ND used for microfluidic control
10kOhm, carbon film resistor, 0.25W DigiKey.com P10KBACT-ND used for microfluidic control
Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% DigiKey.com 478-1841-ND used for microfluidic control
Andor CCD camera Andor Zyla 4.2 Plus SCMOS used for microfluidic on chip imaging
ELISA plate reader
two component Silicone  Momentive RTV 615 used for microfluidic chip fabrication
SU-8 photoresist Micrchem SU8 2015 used for microfluidic chip fabrication
AZ4620 photoresist Clariant AZ 4620 used for microfluidic chip fabrication
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC 32G used for microfluidic chip fabrication
20 Gauge Syringe Needle BD used for microfluidic chip fabrication
Labcycler Sensoquest Labcycler PCR 
DNA polymerase Toyobo KDO Plus PCR amplification
Trimethoprim Sigma
Plate reader Biotek Synergy H1 hybrid  antibiotic resistane measurement

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Liu, P. C., Lee, Y. T., Wang, C. Y., Yang, Y. Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection. J. Vis. Exp. (115), e54426, doi:10.3791/54426 (2016).

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