Summary

Le concept Terroir Interprété par Grape Berry métabolomique et transcriptomique

Published: October 05, 2016
doi:

Summary

Cet article décrit l'application de la métabolomique untargeted, transcriptomique et analyse statistique multivariée à raisin transcriptions de baies et de métabolites, afin de mieux comprendre le concept de terroir, à savoir, l'impact de l'environnement sur les caractéristiques de qualité des baies.

Abstract

Terroir se réfère à la combinaison de facteurs environnementaux qui influent sur les caractéristiques des cultures telles que la vigne (Vitis vinifera) selon des habitats particuliers et les pratiques de gestion. Cet article montre comment certaines signatures du terroir peuvent être détectés dans le métabolome de baies et de transcriptome du Corvina vigne cultivar en utilisant une analyse statistique multivariée. La méthode nécessite d'abord un plan d'échantillonnage approprié. Dans cette étude de cas, un clone spécifique du cultivar Corvina a été choisi pour minimiser les différences génétiques, et des échantillons ont été prélevés dans sept vignobles représentant trois macro-zones différentes au cours de trois saisons de croissance différents. Une LC-MS approche untargeted métabolomique est recommandé en raison de sa sensibilité élevée, accompagnée d'un traitement efficace des données en utilisant un logiciel MZmine et une stratégie d'identification des métabolites basée sur l'analyse de l'arbre de la fragmentation. l'analyse du transcriptome global peut être réalisé en utilisant microarraysLes sondes contenant couvrant ~ 99% de tous les gènes de la vigne prédites, ce qui permet l'analyse simultanée de tous les gènes exprimés de manière différentielle dans le contexte des différents terroirs. Enfin, l'analyse des données multidimensionnelles sur la base de méthodes de projection peut être utilisé pour surmonter l'effet fort spécifiques vintage, permettant aux métabolomique et les données de transcriptomique à être intégrées et analysées en détail pour identifier les corrélations informatives.

Introduction

l'analyse de données à grande échelle basée sur les génomes, transcriptome, protéome et métabolomes de plantes fournit un aperçu sans précédent dans le comportement de systèmes complexes, tels que les caractéristiques du terroir de vin qui reflètent les interactions entre les plantes de la vigne et de leur environnement. Parce que le terroir d'un vin peut être distinct même lorsque des clones de vigne identiques sont cultivées dans différents vignobles, l'analyse génomique est de peu d'utilité parce que les génomes clonales sont identiques. Au lieu de cela, il est nécessaire d'examiner les corrélations entre l'expression génique et les propriétés métaboliques des baies, qui déterminent les caractéristiques de qualité du vin. L'analyse de l'expression des gènes au niveau des transcriptome bénéficie des propriétés chimiques similaires de tous les relevés de notes, ce qui facilite l'analyse quantitative en exploitant des caractéristiques universelles telles que l'hybridation à des sondes immobilisées sur des microréseaux. En revanche, les méthodes d'analyse universelles en protéomique unend métabolomique sont plus difficiles en raison de la grande diversité physique et chimique des protéines et des métabolites individuels. Dans le cas de la métabolomique cette diversité est encore plus extrême parce que les métabolites individuels diffèrent considérablement en taille, la polarité, l'abondance et la volatilité, donc pas de processus d'extraction unique ou méthode analytique offre une approche holistique.

Parmi les plates-formes d'analyse appropriées pour les métabolites non volatils, ceux basés sur la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-MS) sont beaucoup plus sensibles que des alternatives telles que HPLC avec ultraviolets ou diodes détecteurs matriciels (HPLC-UV, HPLC-DAD ) ou par résonance magnétique nucléaire (RMN), mais une analyse quantitative par HPLC-MS peut être influencée par des phénomènes tels que l'effet de la matrice et la suppression d'ions / amélioration 1-3. L'enquête de ces effets lors de l'analyse des Corvina baies de raisin par HPLC-MS en utilisant une source d'ionisation électrospray (HPLC-ESI-MS), a montré que les sucres et d'autres molécules avec des temps les plus faibles de rétention ont été fortement sous-déclarées, reflétant probablement aussi le grand nombre de molécules dans cette zone, et que l'abondance d'autres molécules pourrait être sous-estimée, surestimée ou non affecté par l'effet de la matrice , mais la normalisation des données pour l'effet de la matrice semblait avoir un impact limité sur le résultat de 4,5 globale. Le procédé décrit ici est optimisée pour l'analyse des métabolites à moyen polarité qui accumulent à des niveaux élevés dans les baies de raisin pendant la maturation, et qui sont fortement touchée par le terroir. Ils comprennent anthocyanes, flavonols, flavan-3-ols, procyanidines, d'autres flavonoïdes, le resvératrol, les stilbènes, les acides hydroxycinnamiques et les acides hydroxybenzoïques, qui déterminent ensemble la couleur, le goût et les propriétés liées à la santé des vins. D'autres métabolites, tels que les sucres et les acides organiques aliphatiques, sont ignorées parce que la quantification par CLHP-SM est peu fiable en raison de la matrice effect et la suppression d'ions phénomènes 5. Dans la gamme de polarité sélectionnée par cette méthode, l'approche est untargeted en ce qu'il vise à détecter autant de métabolites différents que possible 6.

Méthodes de transcriptomique permettant des milliers de transcriptions de la vigne à surveiller simultanément sont facilitées par la disponibilité de la séquence du génome de la vigne complète 7,8. méthodes de transcriptomique précoces basées sur séquençage à haut débit d'ADNc ont évolué avec l'avènement du séquençage de nouvelle génération dans une collection de procédures collectivement décrites comme la technologie de l'ARN-Seq. Cette approche est en train de devenir la méthode de choix pour les études de transcriptomique. Cependant, un grand corps de la littérature sur la base de microréseaux, qui permettent à des milliers de transcriptions à quantifier en parallèle par hybridation, a accumulé pour la vigne. En effet, avant l'ARN-Seq est devenue une technologie grand public, de nombreuses plates-formes dédiées microarray commerciales avaient étédéveloppé permettant la vigne transcriptome à inspecter en détail. Parmi la grande variété de plates – formes, deux seulement permis l' analyse du transcriptome génome entier 9. La gamme la plus évolué a permis à l'hybridation de jusqu'à 12 échantillons indépendants sur un seul appareil, réduisant ainsi les coûts de chaque expérience. Les 12 sous-réseaux constitués chacun 135.000 sondes 60-mères représentant 29,549 transcrits de la vigne. Ce dispositif a été utilisé dans un grand nombre d'études 10-24. Ces deux plates – formes ont été abandonnées , mais un nouveau microréseau personnalisé a été récemment conçu et représente un développement plus récent , car il contient un plus grand nombre de sondes représentant des gènes de la vigne nouvellement découverts supplémentaires 25.

Les ensembles de données de grande vente produites par la transcriptomique et la métabolomique analyse nécessitent des méthodes statistiques appropriées pour l'analyse des données, y compris des techniques multivariées pour déterminer les corrélations entre forme différentes de données. Les techniques multivariées les plus utilisées sont celles basées sur la projection, et ceux – ci peuvent être sans surveillance, comme analyse en composantes principales (ACP), ou supervisé, comme projection orthogonale bidirectionnel à des structures latentes analyse discriminante (O2PLS-DA) 26. Le protocole présenté dans cet article utilise PCA pour l'analyse exploratoire des données et O2PLS-DA pour identifier les différences entre les groupes d'échantillons.

Protocol

1. choisir le matériel approprié et construire un plan d'échantillonnage Commencez l'expérience en élaborant un plan d'échantillonnage approprié. Il n'y a pas d'approche générique et universel afin d'évaluer chaque plan au cas par cas. Veiller à ce que le plan d'échantillonnage indique les lieux d'échantillonnage, les heures et la procédure d'échantillonnage précis. Voir la figure 1 pour le plan d'échantillonnage utilisé dans cette ét…

Representative Results

L'étude de cas décrit dans cet article a donné une matrice de données finale comprenant 552 signaux (m / z caractéristiques) , y compris des ions moléculaires ainsi que leurs isotopes, adduits et quelques fragments, relativement quantifiés parmi 189 échantillons (7 vignobles x 3 étapes de maturation x 3 saisons de x croissance 3 répétitions biologiques). Le nombre total de points de données a donc été 104.328. Analyse de l' arbre de Fragmentation a abouti ?…

Discussion

Cet article décrit les métabolomique, de la transcriptomique et des protocoles d'analyse statistiques utilisées pour interpréter la notion de terroir baie de raisin. Analyse métabolomique par HPLC-ESI-SM est suffisamment sensible pour détecter un grand nombre de métabolites simultanément, mais la quantification relative est affectée par l'effet de la matrice et la suppression d'ions / amélioration. Cependant, une approche similaire a déjà été utilisé pour décrire la maturation et de dépéris…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.

Materials

Mill Grinder IKA IKA A11 basic
HPLC Autosampler Beckman Coulter  - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter  - System Gold 127 Solvent Module HPLC
C18 Guard Column Grace  - Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column
C18 Column Grace  - Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column
Mass Spectometer Bruker Daltonics  - Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap.
Extraction solvents and HPLC buffers Sigma 34966 Methanol LC-MS grade
Sigma 94318 Formic acid LC-MS grade
Sigma 34967 Acetonitrile LC-MS grade
Sigma 39253 Water  LC-MS grade
Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) Sartorius 17764
Softwares for data collection (a) and processing (b) Bruker Daltonics Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b)
Spectrum Plant Total RNA kit Sigma-Aldrich STRN250-1KT For total RNA extractino from grape pericarps
Nanodrop 1000 Thermo Scientific 1000
BioAnalyzer 2100 Agilent Technologies G2939A
RNA 6000 Nano Reagents Agilent Technologies 5067-1511
RNA Chips Agilent Technologies 5067-1511
Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 Agilent Technologies 5188-5325
Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 Agilent Technologies 5188-5326
LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color Agilent Technologies 5190-2305
Kit RNA Spike In – One-Color Agilent Technologies 5188-5282
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242
RNeasy Mini Kit (50) Qiagen 74104 For cRNA Purification
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray Agilent Technologies G2514F-048771 
eArray Agilent Technologies https://earray.chem.agilent.com/earray/
Gasket slides Agilent Technologies G2534-60012 Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization
Thermostatic bath Julabo
Hybridization Chamber Agilent Technologies G2534-60001
Microarray Hybridization Oven Agilent Technologies G2545A
Hybridization Oven Rotator Rack Agilent Technologies G2530-60029
Rotator Rack Conversion Rod Agilent Technologies G2530-60030
Staining kit Bio-Optica 10-2000 Slide-staining dish and Slide rack
Magnetic stirrer device AREX Heating Magnetic Stirrer F20540163 
Thermostatic Oven Thermo Scientific Heraeus – 6030
Agilent Microarray Scanner Agilent Technologies G2565CA
Scanner Carousel, 48-position Agilent Technologies G2505-60502
Slide Holders Agilent Technologies G2505-60525
Feature extraction software v11.5 Agilent Technologies inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA
SIMCA + V13 Software Umetrics

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Dal Santo, S., Commisso, M., D’Incà, E., Anesi, A., Stocchero, M., Zenoni, S., Ceoldo, S., Tornielli, G. B., Pezzotti, M., Guzzo, F. The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics. J. Vis. Exp. (116), e54410, doi:10.3791/54410 (2016).

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