Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em> Coxiella burnetii</em> Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii ist ein einzigartiges intrazelluläre Erreger der zoonotischen Infektionen beim Menschen Q – Fieber verursacht. Diese Krankheit wird mit einem breiten Spektrum von klinischen Präsentationen im Zusammenhang von asymptomatischen Serokonversion zu lebensbedrohlichen chronischen Infektion erstreckt , die als Endokarditis Jahre nach der Exposition ¹ oft manifestiert. Die Infektion des Menschen erfolgt in erster Linie durch das Einatmen von kontaminierten Aerosolen mit Wiederkäuern der großen Reservoir für Infektionen, insbesondere Milchkühe, Schafe und Ziegen. Obwohl Coxiella Infektion bei diesen Tieren der Regel subklinischen ist, kann die Infektion Abtreibung auslösen und die erhebliche bakterielle Belastung innerhalb der Entbindungs ​​Flüssigkeit und Plazenta kann die lokale Umgebung ¹ verunreinigen. Ein Beispiel für die enorme Belastung eine solche Kontamination kann sowohl auf die öffentliche Gesundheit haben und die Agrarindustrie vor kurzem in der Q – Fieber – Ausbruch beobachtet wurde , die in den Niederlanden ² aufgetreten ist . Zwischen 2007 und2010 mehr als 4.000 menschliche Fälle von Q – Fieber diagnostiziert wurden und dieser Ausbruch zu erheblichen Kontamination von Ziegenbetriebe ³ wurde verknüpft. Darüber hinaus ist Coxiella eine potenzielle biologische Waffe, wie für Disease Control von den US Centers klassifiziert und Prävention, durch die Umweltstabilität der Bakterien und geringe Infektionsdosis erforderlich schwere Morbidität und Mortalität ⁴ zu verursachen.

Coxiella existiert in zwei Phasen: Phase I Organismen, isoliert aus natürlichen Quellen, sind extrem virulent und Phase – II – Organismen in vivo stark gedämpft. Beispielsweise nach mehreren in vitro Passagen Coxiella burnetii Nine Mile Phase I Organismen, Phase II Bakterien produziert wurden , die eine irreversible chromosomale Deletion in abgeschnittene Lipopolysaccharid (LPS) enthalten ^5. Dieser Stamm, C. burnetii NMII ist phänotypisch ähnlich ich in Gewebekulturmodellen zu Phase und bietet einen sichereren Modusl für Forscher Coxiella Pathogenese in Laboratorien zu untersuchen ^5. In den letzten Jahren haben mehrere Durchbrüche auf dem Gebiet der Genetik Coxiella rasch vorangetrieben . Vor allem die Entwicklung von axenic Medien (Citrat Cystein Medium angesäuert – ACCM-2) hat die zellfreie Wachstum von Coxiella sowohl in flüssiger und auf festen Medien ^6,7 erlaubt. Dies führte zu direkten Verbesserungen der genetischen Werkzeuge zur Verfügung , für Coxiella einschließlich eines induzierbaren Genexpressionssystem, Shuttle – Vektoren und zufällige Transposon – Systeme ^11.08. In jüngster Zeit werden zwei Verfahren zur gezielten Geninaktivierung sind ebenfalls entwickelt worden, die den Weg für ¹² spezifische Virulenzgen Kandidaten untersucht.

Folgende Internalisierung durch Alveolarmakrophagen, repliziert Coxiella zu hohen Zahlen innerhalb eines membrangebundenen Kompartiment bezeichnet die Coxiella- enthält Vakuole (CCV). Der CCV erfordert Host endocytic Handel thrau frühen und späten Endosomen , bis es reift in ein Lysosom abgeleiteten Organell ^13. Im Laufe dieses Prozesses erwirbt der CCV Wirtsfaktoren , die entweder vorübergehend erscheinen oder bleiben mit der Vakuole verbunden sind , einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Rab5, Rab7, CD63 und LAMP-1 . ^13-15 Die Replikation von Coxiella innerhalb von Wirtszellen ist völlig abhängig von einem voll funktionsfähigen Dot / Icm Typ IVB – Sekretionssystem (T4SS) ^8,16,17. Dieses Sekretionssystem ist ein Multi-Proteinstruktur ancestrally Konjugation Systemen und erstreckt sich über sowohl bakterielle als auch vacuolar Membranen bakterielle Proteine ​​zu liefern, bezeichnet als Effektoren in das Wirts Zytoplasma ^18. Die Coxiella T4SS funktionell sehr ähnlich dem gut charakterisierten Typ IVB Dot / Icm Sekretionssystem von Legionellen pneumophila ^19,20. Interessanterweise Aktivierung des T4SS und nachfolgende Translokation Effektor nicht auftritt , bis die saure Coxiella Lysosom-derived erreichtOrganell, etwa 8 Stunden nach der Infektion ^17,21. Bis heute sind über 130 Dot / Icm Effektoren wurden ^9,17,22-24 identifiziert. Viele dieser Effektoren spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Replikation von Coxiella in Wirtszellen; jedoch nur wenige Effektoren wurden funktionell ^25-29 charakterisiert.

In dieser Studie nutzen wir eine fluoreszenzbasierten Translokation Assay, der auf der Spaltung des (bezeichnet im Folgenden als BlaM Substrat) CCF2-AM FRET Substrat stützt über β-Lactamase – Aktivität in der Wirtszelle Zytoplasma (Abbildung 1). Das Gen von Interesse fusioniert an TEM-1-β-Lactamase (BlaM) auf einem Reporterplasmid, das eine konstitutive Expression sorgt. Das BlaM Substrat besteht aus zwei Fluorophore (Cumarin und Fluorescein), die ein FRET-Paar bilden. Anregung der Cumarin Ergebnisse in FRET des Fluorescein und grüne Fluoreszenzemission in Abwesenheit von Effektorzellen Translokation; Wenn jedoch die BlaM-Effektor-Fusionsprotein wird in das Wirts Zytoplasma transloziert, die sich ergebende β-Lactamase-Aktivität spaltet die β-Lactam-Ring des BlaM Substrat, wobei das FRET-Paar produzieren blaue Fluoreszenzemission nach Anregung zu trennen. Diese Translokation Assay wurde als ein Ansatz zur Identifizierung Effektor – Proteine ​​aus einer Reihe von verschiedenen intra- und extrazellulären Bakterien gut bewährt, einschließlich C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, darmpathogene E. coli, Salmonella und Brucella ^17,30-35.

Um die Rolle der spezifischen Wirtsfaktoren auf Coxiella Effektor Translokation bestimmen verwenden wir ein gut etabliertes Verfahren zur Gen – Silencing als RNA – Interferenz bekannt, insbesondere small interfering RNA (siRNA). Ursprünglich in Caenorhabditis elegans identifiziert, ist die RNA – Interferenz ein konserviertes endogenen zellulären Prozess für angeborene defe verwendetnse gegen Viren sowie der Genregulation ^36,37. Von sequenzspezifischen siRNA, Abbau von mRNA erfolgt durch RISC (RNA-induced silencing complex) , was zu spezifischen Gen – Silencing oder Zuschlags ³⁸ nach der Bindung. In dieser Studie wurde siRNA zwei Wirtsproteine ​​zu zielen, RAB5A und Rab7A, die wichtige Regulatoren des endocytischen sind. Die Auswirkungen der RAB5A und Rab7A auf Effektor – Translokation zum Schweigen zu bringen wurde mit C ermittelt burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 ausgewählt wurde , wie es zuvor durch die Dot / Icm Sekretionssystem von Coxiella ¹⁷ transloziert werden , wurde gezeigt.

Unter Verwendung sowohl siRNA Gen – Silencing und die fluorescencebased Translokation Assay hier beschrieben, beginnen wir eine Rolle für die Wirtsfaktoren bei der Translokation von Effektor – Proteine ​​, die durch Coxiella zu etablieren. Dieser Ansatz kann auf eine breite Palette von sowohl intra- und extrazellulären Bakterien angewendet werden, die ähnliche secretio besitzenn-Systeme, die für die Translokation von Effektor-Proteine.