Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
I metodi qui presentati hanno lo scopo di elaborazione registrazione della temperatura nel bulbo olfattivo di Xenopus laevis girini. Le macchie protocollo prime e neuroni secondo ordine nel bulbo olfattivo e fornisce una preparazione del campione in cui il sistema olfattivo rimane essenzialmente intatto. Così, l'attivazione del γ-glomerulo sensibile alla temperatura può essere monitorato e confrontato con i glomeruli vicini chemio-sensibili. L'innervazione bilaterale unica di questo glomerulo viene visualizzato mediante elettroporazione di cellule con spettralmente diversi coloranti. Inoltre, bolo loading consente la colorazione di cellule mitrali coprono un ampio volume all'interno del bulbo olfattivo. I segnali di temperatura indotte neuronali di elaborazione di rete si rivela prendendo le misure del calcio con le applicazioni di stimolo ripetute e, successivamente, l'analisi dei dati con l'imaging di correlazione attività.
Il protocollo mette in evidenza due sofisticati proce colorazione dure, che richiedono entrambi manipolazione e pratica prudente per ottenere risultati soddisfacenti e riproducibili. Durante l'elettroporazione alcun danno degli animali deve essere evitato, soprattutto quando il posizionamento degli elettrodi nelle narici. In modo ottimale, dovrebbe verificarsi alcun contatto con l'epitelio olfattivo. Si noti che gli animali sono ancora in vita dopo la procedura di elettroporazione e il loro tempo di recupero devono essere prese in considerazione. Se la colorazione rimane troppo debole dopo un giro di elettroporazione, che può accadere a seconda dei tipi di coloranti usati, l'intensità può essere aumentata aumentando la concentrazione di colorante nelle narici. Poiché le molecole di destrano accoppiamento vengono trasportati attraverso diversi meccanismi compreso il trasporto assonale lento (alla velocità di 1-2 mm / giorno 10) e diffusione passiva, un'altra alternativa è quella di attendere 48 ore dopo l'elettroporazione prima sacrificando gli animali. In alternativa, l'elettroporazione può essere ripetuto dopo un giorno di recupero.
jove_content "> bolo di carico è una fase critica poiché la quantità di colorante entrare nelle cellule mitrali è difficile regolare e dipende da vari parametri come la dimensione puntale e posizione dell'applicazione. Monitoraggio procedura sotto un microscopio a fluorescenza confocale rivela utile per regolando la durata dell'applicazione tintura e generare risultati di colorazione simili attraverso preparazioni così. Inoltre, girini precedenza elettroporate dovrebbero essere utilizzati per determinare la posizione migliore per l'applicazione dye individuando la posizione del piccolo gruppo (comprendente la γ-glomerulo). il più passaggio critico durante le misure è di evitare sia spostamento e candeggio del campione. lo spostamento può essere evitato posizionando accuratamente il flusso Ringer al microscopio. Come per limitare sbiancare la zona di interesse, il tempo di misura deve essere ridotto all'essenziale .Bolo di carico colorazione con coloranti calcio-sensibili prevede solo moltocontrasto limitato in quanto le cellule sane in genere hanno bassi livelli di calcio e quindi mostrare debole fluorescenza basale. L'applicazione di imaging di correlazione attività aggira questa limitazione generando invece sulla base di strutture di attività e mette in evidenza con segnali di calcio simili. Questo metodo di analisi post-acquisizione calcola il fattore di correlazione tra il segnale di calcio di una regione selezionata di interesse (traccia di riferimento) e quella di ogni singolo pixel nel volume 3D. Pertanto, i risultati ottenuti fortemente dipendono dal modello di attività selezionata come traccia di referenza. Se l'obiettivo principale è quello di visualizzare i modelli di innervazione delle cellule mitrale, un segnale di riferimento derivato da attività neuronale spontanea è preferito, e scegliendo le cellule mitrale più attivi produrrà i migliori risultati. Per rivelando le reti chemio o termo-sensibili di cellule mitrale, tracce di riferimento che contengono solo le risposte a entrambi istidina o Ringer freddo dovrebbero essere selezionati. La selezione di un intero glomerulo or soma cellula mitrale come regione di interesse non può sempre fornire una chiara traccia di riferimento, soprattutto se le strutture rispondenti ai due stimoli differenti sono distesi l'uno sopra l'altro. In tal caso, è spesso utile selezionare un'area più piccola del glomerulo o corpo cellulare come regione di interesse.
Negli ultimi decenni, elettroporazione è stato descritto come un metodo efficiente per colorare le cellule singole o multiple 11,12. Qui viene utilizzato per etichettare specificamente neuroni olfattivi. Molecole di destrano coniugato dare la massima efficienza, e coloranti non sensibili calcio, la gamma di selezione è ampia e copre l'intero spettro tipicamente utilizzati in microscopia a fluorescenza 13. Tuttavia, coloranti calcio-sensibili che sono elettroporate con successo in neuroni recettori olfattivi sono momentaneamente limitato a destrano calcio-verde, e Fluo-4 destrano se ancora disponibili commercialmente. Inoltre, le registrazioni si rivolge principalmente superficiaL strati sulla superficie ventrale solo il bulbo olfattivo, dal momento che la profondità di penetrazione delle tecniche di misurazione veloce è limitata. due fotoni di imaging può in parte ovviare a questa limitazione, ma spesso manca velocità e limita ulteriormente la quantità di coloranti calcio-sensitive selezionabili.
Abbiamo descritto qui un protocollo per la misurazione dell'attività di temperatura indotta nel bulbo olfattivo. Il neuropil cervello è scansionato come un tre dimensioni dello spazio di visualizzare le complesse reti cellulari coinvolti nella trasformazione olfattivo della temperatura. Misurazione dell'attività di temperatura indotte nel bulbo olfattivo è stato recentemente riportato 5 e richiede una procedura appositamente personalizzato combinando tecniche diverse. Un importante vantaggio delle tecniche presentate sopra è che centinaia di cellule vengono esposte in tre dimensioni in un preparato in cui la maggior parte del sistema olfattivo rimane intatto. Questi vantaggi messo richiede alle tecniche di colorazione così come il cervello priparazione e di imaging. Ad esempio, elettroporazione cellulare e bolo loading colpito vaste quantità di cellule nell'epitelio olfattivo e bulbo, e consentono quindi la visualizzazione di reti cellulari completi. Inoltre, la fornitura di indicatori chimici tramite loading bolo invece di fluorofori geneticamente codificati consente misurazioni in un insieme potenzialmente maggiore di specie. Altre alternative come il bagno di incubazione con AM coloranti lavorano principalmente a fette che danneggiano il bulbo olfattivo gravemente, lasciando solo qualche centinaio di micrometri di tessuto intatto. In confronto, l'intera preparazione monte utilizzato nel nostro protocollo assicura per esempio che il innervazione bilaterale del γ-glomerulo rimane intatto e le registrazioni sono quindi prese in un sistema ancora in funzione. Infine, l'immagine stesso si è fatto tramite microscopia line-illuminazione che consente l'acquisizione di volumi 3D. Linea-illuminazione microscopia è una delle tecniche confocale fornire la massima velocità di acquisizione possibili 6 </ Sup>, che sono necessari per coprire una grande frazione del bulbo olfattivo. sistemi di acquisizione più lenti possono essere utilizzati, ma hanno lo svantaggio che la dimensione del volume registrata deve essere ridotto. Negli ultimi anni, altri metodi per l'acquisizione di immagini veloce sono stati sviluppati e possono essere utilizzati come alternative 14,15. Tuttavia, la linea-illuminazione microscopia rimane uno dei metodi più semplici per ottenere velocità e risoluzione sufficiente. Qui di seguito alcune informazioni come linee guida per la selezione di adeguate impostazioni di imaging. Dal momento che l'imaging calcio è fatto all'interno di preparati cervello di spessore, la configurazione dovrebbe fornire parafocalità decente e gli obiettivi deve avere aperture numeriche di 1.0 o superiore. Per un punto di riferimento, le registrazioni effettuate con il microscopio illuminazione linea corrispondono alle immagini scattate con un microscopio a scansione laser standard con una dimensione foro stenopeico di 0,5-1 unità ariose. velocità di acquisizione è desiderabile. Un volume con uno spessore di 20 micron coperto da almeno 5 layers, un campo laterale di vista 100 micron x 100 micron e una dimensione del pixel di 0,5 micron o inferiore dovrebbe scandire ad una velocità minima di 1 Hz per stack. Ridurre il parafocalità può aumentare la quantità di fotoni contati e permette quindi per acquisizioni veloci se necessario, ma ha lo svantaggio di registrazione più luce fuori fuoco. Tuttavia, poiché tale approccio aumenta lo spessore delle fette ottici, in realtà può agevolare la tracciabilità delle dendriti attraverso diversi z-piani dopo l'applicazione di ACI 6.
Gli strumenti necessari per studiare estesamente elaborazione temperatura nelle reti bulbo olfattivo sono presentati nel presente documento. attività di Temperatura-indotta è registrato in primo e secondo neuroni ordine via coloranti e segnali sia in arrivo e in partenza dalla γ-glomerulo calcio-sensibili. Inoltre, la misura in cui le singole cellule mitrali processare sia informazioni chimiche e la temperatura può essere valutato. Dal momento che la lea preparazioneves bulbo olfattivo intatta, il ruolo della innervazione bilaterale in lavorazione olfattiva può essere ulteriormente studiato. La procedura è utile anche per rivelare se e come termo e chemoinformation è codificato in sovrapposizione reti olfattive 5. Infine, le tecniche di cui sopra non sono limitati allo studio delle risposte di temperatura nel bulbo olfattivo, ma può essere applicato per una valutazione più generale del sistema olfattivo, specialmente le reti di elaborazione cellulari in grandi tre volumi tridimensionali. Bolo di carico e di imaging di correlazione attività sono strumenti potenti per osservare e confrontare l'attività di decine di neuroni, rendendoli applicabili a diverse reti del cervello 16.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Reagents | |||
Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
Funnel applicator | (Custom-made) | ||
Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |