يصف هذا العمل في المختبر بروتوكول التمايز لإنتاج الصباغية، الخلايا الصباغية ناضجة من خلايا جذعية المحفزة الإنسان عبر قمة العصبية وميلانينية المرحلة المتوسطة باستخدام، بروتوكول خالية من تغذية 25 يوما.
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) توفير منصة لتقليد التمايز الطبيعي بطريقة قابلة للنمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاجات البديلة للخلية 1-6. ذات أهمية خاصة، hPSCs تفتح آفاقا لدراسة الصعب عزل أو أنواع الخلايا نادرة / عابرة حيث عينات المرضى شحيحة. وعلاوة على ذلك، التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) تمكن الباحثون لدراسة تطوير والنمذجة المرض بطريقة محددة المريض لكشف آليات فريدة 1،2،7-11. يتطلب بروتوكول نشرت سابقا عن تمايز الخلايا الصباغية من hPSCs تصل إلى 6 أسابيع من التفرقة وينطوي على خلايا زراعة مع المتوسط مكيفة من خلايا L-Wnt3a 12. بروتوكول قدمت لأول مرة من قبل ميكا وآخرون وصفت هنا تنتج الخلايا الصباغية في ثلاثة أسابيع وإزالة الغموض والتناقضات المرتبطة المتوسطة مشروط.
الخلايا الصباغية عالبريد المستمدة من قمة العصبية، والسكان المهاجرين من خلايا فريدة من نوعها لالفقاريات. يتم تعريف قمة العصبية خلال المعيدة ويمثل السكان من الخلايا على حافة لوحة العصبية، على الحدود بين العصبية والأديم الظاهر غير العصبية. أثناء تكون العصيبة، النسيج العصبي يتطور من لوحة العصبية لتشكيل طيات العصبية، التي تلتقي في خط الوسط ظهري مما أدى إلى 13،14 الأنبوب العصبي.
الخلايا قمة العصبية الخروج من لوحة سطح الأنبوب العصبي، مقابل الحبل الظهري، وتخضع لالظهارية للانتقال الوسيطة قبل أن يهاجر بعيدا أن تؤدي إلى مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا المتمايزة. وتعرف مصير الخلايا قمة في جزء من الموقع التشريحي لوحة السقف على طول محور جسم الجنين. وتشمل العصبية المشتقات خلية قمة الأنساب مميزة لكل من الأديم المتوسط (خلايا العضلات الملساء، بانيات، الخلايا الشحمية، غضروفية) وخلايا الأدمة (الخلايا الصباغية، شوان جملتعلمي اللغة اإلنكليزية، الخلايا العصبية) 14. العصبية الخلايا الجذعية قمة upregulate عامل النسخ SOX10، ويمكن أن تكون معزولة من قبل مضان تنشيط الخلايا الفرز مع الأجسام المضادة لP75 وHNK1.
الخلايا العصبية قمة الطالع أن تصبح الخلايا الصباغية تمر عبر مرحلة ميلانينية وupregulate KIT وMITF (المرتبط صغر عامل النسخ) 6،21 MITF هو منظم رئيسي للتنمية الخلايا الصباغية وهو عامل النسخ المسؤولة عن السيطرة على جزء كبير من تطوير الخلايا الصباغية 22- 24. melanoblasts الإنسان تهاجر إلى الطبقة القاعدية من البشرة التي يقيمون فيها سواء في انتفاخ الشعر أو تحيط بها الخلايا الكيراتينية في البشرة (تشكيل وحدة تصبغ) لتكون بمثابة السلائف إلى ناضجة، الخلايا الصباغية المصطبغة. والتمايز والنضج من melanoblasts إلى الخلايا الصباغية مصطبغة يحدث ما يصاحب ذلك مع الاستعمار لبصلة الشعر والتعبير عن مسار إنتاج الميلانين (TYRP1، صور، OCA2 وPMEL) 25،26.
عزل الخلايا الصباغية الإنسان وmelanoblasts من المرضى غير مكلفة، وصعبة وتحد في الكمية. يتيح هذا البروتوكول الباحثون أن نفرق hPSCs (محدث أو الجنينية) في الخلايا الصباغية أو السلائف الصباغية في طريقة واضحة المعالم، السريع، قابلة للتكرار، قابلة للتطوير، وغير مكلفة من دون فرز الخلايا. تم استخدام بروتوكول سابقا لتحديد العيوب مرض محدد عند التفريق iPSCs من المرضى الذين يعانون من اضطرابات تصبغ.
لالتمايز الناجح الخلايا الصباغية من hPSCs ينبغي أن تؤخذ في الاقتراحات التالية بعين الاعتبار. أولا وقبل كل شيء، لا بد من العمل في ظل ظروف ثقافة عقيمة في جميع الأوقات. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن تبدأ مع المحفزة، hPSCs غير متمايزة تماما. إذا كان السكان بدءا يحتوي على خلايا …
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل الزمالة للباحثين سرطان الجلد من مؤسسة جوانا م نيكولاي ومن قبل المعاهد الوطنية للصحة تحت روث L. جائزة الخدمة القومي للبحوث كيرشتاين F31. وأيد هذا العمل كذلك من خلال المنح المقدمة من NYSTEM ومبادرة الخلايا الجذعية ثلاثي المؤسسية (مؤسسة ستار).
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Human insulin | Sigma | I2643 | |
ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
Selenite | Sigma | S5261 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |