الفروق بين الجنسين في ماوس الحصين النجمية بعد<em> في المختبر</em> نقص التروية
Summary
الخلايا النجمية هي واحدة من اللاعبين الرئيسيين الأكثر أهمية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). هنا، نحن الإبلاغ عن طريقة عملية من تلاعب الحصين بروتوكول ثقافة نجمية من أجل دراسة الآليات الكامنة وراء وظيفة نجمية في الذكور والإناث الجراء الوليد بعد في المختبر نقص التروية.
Abstract
دباق النجمي التالية نقص الأكسجة / نقص التروية (مرحبا) إصابات الدماغ ذات الصلة ب يلعب دورا في زيادة معدلات الاعتلال والوفيات عند الولدان. وتشير الدراسات السريرية الحديثة أن شدة إصابات الدماغ يبدو أن ممارسة الجنس تعتمد، وأن الولدان الذكور أكثر عرضة لآثار إصابات الدماغ المرتبطة مرحبا، مما أدى إلى نتائج عصبية أشد بالمقارنة مع الإناث مع إصابات الدماغ قابلة للمقارنة. تطوير وسائل موثوق بها لعزل والمحافظة على السكان عالي التخصيب من الخلايا النجمية الحصين بالغت أمر ضروري لفهم الأساس الخلوي للفروق بين الجنسين في النتائج المرضية مرحبا حديثي الولادة. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة لخلق الجنس الثقافات نجمية الحصين المحددة التي تتعرض للنموذج في المختبر نقص التروية، والحرمان من الأوكسجين الجلوكوز، تليها عودة التأكسج. تم فحص دباق النجمي رد الفعل لاحق من immunostaiنينغ للبروتين الدبقية ييفي الحمضية (GFAP) وS100B. هذا الأسلوب يوفر أداة مفيدة لدراسة دور الذكور والإناث النجمية الحصين التالية مرحبا حديثي الولادة، كل على حدة.
Introduction
الخلايا النجمية هي واحدة من اللاعبين الرئيسيين الأكثر أهمية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). متزايد من الأدلة يشير إلى أن أدوار الخلايا النجمية هي أكثر من مجرد تقديم الدعم العصبية. في الواقع، يمكن للأدوار الخلايا النجمية في ظل الظروف الفسيولوجية تكون معقدة جدا، مثل توجيه الهجرة من محاور تطوير 1، وتنظيم الجهاز العصبي المركزي تدفق الدم 2، والحفاظ على توازن درجة الحموضة في السائل الخلالي متشابك 3، والمشاركة في حاجز الدم في الدماغ 4 وانتقال متشابك 5. في ظل ظروف مرضية، النجمية تستجيب للإصابة مع عملية تسمى دباق النجمي رد الفعل الذي التشكل، عدد، موقع، والطوبوغرافيا (فيما يتعلق المسافة من الإهانة) وظيفة من وظائف الخلايا النجمية قد تتغير بطريقة متجانسة 6،7. دباق النجمي ينظر التالية حديثي الولادة الاعتلال الدماغي نقص تروية ميتة ربما يسهم في الإصابة بالأمراض والوفيات بين حديثي الولادة <sتصل> 8.
وتشير الدراسات السريرية والتجريبية الحديثة أن شدة إصابات الدماغ ويبدو أن تعتمد على الجنس وأن الولدان الذكور أكثر عرضة لآثار نقص الأكسجة / نقص التروية (مرحبا) إصابات الدماغ ذات الصلة ب، مما أدى إلى نتائج عصبية أشد بالمقارنة مع الإناث مع إصابات المخ مقارنة 9-11. على الرغم من أن توطين إصابة يعتمد على عمر الحمل ومدة وشدة الإهانة، قرن آمون هو واحد من أكثر المناطق تنفذ عادة في الجهاز العصبي المركزي بعد مرحبا حديثي الولادة المدى، وزيادة تم تأكيد دباق النجمي الحصين بنسبة تصل التنظيم من البروتين الدبقية ييفي الحمضية (GFAP) 3 د بعد مرحبا حديثي الولادة 7،10،12،13. وقد أظهرت الفروق بين الجنسين في وظيفة الخلايا النجمية في كل من حديثي الولادة والقوارض الكبار بعد نقص التروية الدماغية 14،15. وبالإضافة إلى ذلك، فقد تبين قابلية نجمي الذكور إلى نقص التروية في المختبر عن طريق زيادة سلالموت ل بالمقارنة مع الخلايا النجمية القشرية الإناث في الثقافة 16.
تبدأ الفروق بين الجنسين في الرحم وتستمر حتى الموت 17. على مدى العقد الماضي، كانت أهمية إدراج الجنسين في ظروف تجريبية في زراعة الخلايا وفي الدراسات المجراة التركيز من معهد الطب والمعاهد الوطنية للصحة لطلب المعرفة الأساسية في الفروق بين الجنسين ينظر في الظروف الفسيولوجية والمرضية 17،18 . تطوير وسائل موثوق بها لعزل والمحافظة على السكان من الخلايا النجمية الحصين بالغت أمر ضروري لفهم الأساس الخلوي للفروق بين الجنسين في النتائج المرضية مرحبا حديثي الولادة. وقد تم تصميم هذه الدراسة لتوفير التقنيات اللازمة لإعداد المخصب مصنفة حسب الجنس الثقافات نجمية الحصين من الفئران حديثي الولادة من أجل تقييم أدوار الخلايا النجمية GFAP-مناعيا التالية الأوكسجين / الجلوكوز الحرمان (OGD) وعودة التأكسج (REOX)، الأمر الذي أدىمرحبا في بيئة زراعة الخلايا. هذه التقنية يمكن استخدامها لاختبار أي فرضية تتعلق النجمية قرن آمون في الذكور والإناث حديثي الولادة في ظل ظروف normoxic والدماغية.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل دراسة الفروق بين الجنسين في خصائص وظيفة الخلايا النجمية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية، وإعداد الخلايا النجمية الأولية بالغت في زراعة الخلايا هو أداة هامة في الاستفادة منها. في هذه الدراسة فإننا الإبلاغ عن كفاءة عالية وأسلوب استنساخه للثقافة التخصيب السك…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Altro | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
Riferimenti
- Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
- Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
- Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
- Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
- Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
- Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
- Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
- Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
- Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
- McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
- Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
- Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
- Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
- . Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women’s health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
- Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
- McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
- Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
- Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).
