Всего горе Вскрытие и Иммунофлуоресценции взрослых мышей улитки
Summary
Мы представляем метод, чтобы изолировать взрослых орган Корти, как три неповрежденных кохлеарных поворотов (вершины, середины и основания). Мы также продемонстрировать процедуру иммуноокрашивания с флуоресцентно меченых антител. Вместе эти методы позволяют изучать волосковых клеток, поддерживающих клеток, и другие типы клеток, найденный в улитку.
Abstract
The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.
Introduction
Спираль-образный улитка внутреннего уха, содержащиеся в височной кости, находится орган Корти, слуховой сенсорной конечного органа у млекопитающих. Улитки tonotopically организованы и обычно делится на апикальной, средней и базальной поворачивает соответствующие различным частотных областей с обнаружением звукового высокочастотного в основании и низкой частоты обнаружения в вершине 1. Клетки волос, механосенсорные клетки органа Корти, запустите длину улитки, который давно примерно 6 мм у мышей 2,3. Эти клетки преобразуют механическую энергию звуковых волн, которые передаются через заполненный жидкостью перепончатого лабиринта, в нервные сигналы, обработанные посредством центральных слуховых структур. Описанная методика здесь обеспечивает способ получения тотальных органа Корти после кальцификации улитки завершения (для образцов от одной недели возраста к взрослой жизни). Мы также представляем метод для immunostaоцен- ками в целом установлен кохлеарной ткани. Кохлеарные тотальных являются критическими для визуализации всех клеток и волос окружающие поддерживающие клетки в их естественной пространственным расположением и позволяют анализа в трех измерениях с использованием конфокальной микроскопии.
Доктора. Ханс Engstrom и Харлоу Адес первоначально описан целый монтировать кохлеарной метод вскрытия в 1966 году они подробно технику, чтобы быстро исправить и анализировать кальцинированная cochleae погруженный в жидкость из различных млекопитающих, сохраняя нетронутыми короткие сегменты органа Корти для микроскопического анализа 4. Рассечение незафиксированного, кальцинированная крысы улитки также были проиллюстрированы в качестве учебного видео 5. Доктора. Барбара Bohne и Гэри Хардинг в Университете Вашингтона сделал несколько важных изменений в этом методе. По их версии всей метода кохлеарной горе, временная кость декальцифицировали, встроенные в пластик, и пять полуоборотов или десять четверть-оборота были dissecТед 6,7. Доктор Чарльз Либерман и его коллеги Eaton Пибоди, Массачусетс Laboratories глаз и ухо лазарете, модифицированный эту технику так, что пластик вложение не требуется 8. Кроме того модификация техники произошел в лаборатории доктора Цзянь Цзо в исследовательского госпиталя Святого Иуды детей 9-12, которые сообщили метод вскрытия представленные здесь. Мы используем различные стратегии, чтобы получить доступ к органа Корти, чем Bohne и Либермана, который позволяет изоляцию полной верхушечные, середине и базальных поворотов. Таким образом, расчлененный ткани больше и менее вероятно, чтобы быть потеряны или повреждены во время вскрытия или иммуноокрашивания процессов. Кроме того, в настоящее время метод облегчает измерение расстояния от апикальной наконечником или базальной крюк, чтобы определить область частот.
Хотя многие лаборатории выполняют иммунное кохлеарной ткани, непонятно, где этот метод возник. В результате существуют различные рецепты для блокирования BuffeRS и антитела инкубации буферы, которые могут повлиять на производительность отдельных первичных антител. Здесь мы представляем один метод для иммуноокрашивания с флуоресцентно меченых антител, которые применяется к наиболее часто используемых антител в слуховой области.
Сложная форма улитки, нежная структура органа Корти, и костлявая обделки обеспечить вызов для гистологического и биохимического анализа. Разнообразие методов в настоящее время используется в области слуха преодолеть эти трудные функции и визуализировать клетки внутри органа Корти, каждого метода с собственными преимуществами и недостатками. Протокол, представленные здесь позволяет всей горе вскрытии улитки взрослых мышей, и с небольшим изменением, потенциально могут быть использованы для изучения критических структур внутри cochleae из различных других модельных организмов, используемых в этой области.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько важных шагов для успешного всей горе вскрытии и иммунной окраски. Однако прежде любой из этих методов выполняются, собственно фиксация улитки ткани необходим. Мы рекомендуем использовать метанол бесплатно, ультра-чистое, Е. М. класса PFA. PFA изготовлен из порошка может ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).
Materials
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC –wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48 well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8 well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
Riferimenti
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. . Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters’ cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
