ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול
Summary
אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.
Abstract
The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.
Introduction
השבלול בצורת הספירלה של האוזן הפנימית, בתוך העצם הטמפורלית, בתי האיבר של קורטי, איבר השמיעה החושי הסוף ביונקים. השבלול מאורגן tonotopically ומחולק בדרך כלל לפסגה, אמצע, ובסיס פונה מתאים לאזורים שונים בתדירות עם זיהוי קול בתדר גבוה בבסיס וזיהוי בתדר נמוך בקודקוד 1. תאי שיער, תאי mechanosensory של האיבר של קורטי, לאורכו של שבלול האוזן, שהם כ 6 מ"מ ארוך בעכברי 2,3. תאים אלה להמיר את האנרגיה המכנית של גלי קול, שמועברים דרך המבוך הקרומי מלא הנוזל, לאותות עצביים המעובדים על ידי מבנים שמיעתיים מרכזיים. הטכניקה המתוארת כאן מספקת שיטה להכנת mounts של האיבר של קורטי כל אחרי ההסתיידות של השבלול היא מלאה (לדגימות החל שבוע בגיל אחת לבגרות). כמו כן, אנו מציגים שיטה לimmunostaining כל רכוב רקמת שבלול. mounts כל שבלול הם קריטיים להדמיה של כל תאי השיער ותאים המקיפים את תמיכה בסידורים מרחביים הטבעיים שלהם ולאפשר לניתוח בשלושה ממדים בשימוש במיקרוסקופ confocal.
בני הזוג. האנס Engstrom והארלו עדס במקור תיארו שיטת הר שלמה שבלול נתיחה בשנת 1966. הם מפורטים טכניקה לתקן במהירות ולנתח cochleae המסויד שקוע בנוזל ממגוון רחב של יונקים, שמירת מגזרים שלמים קצרים של האיבר של קורטי לניתוח מיקרוסקופי 4. הנתיחה של שבלול עכברוש מבולבל, מסויד גם כבר מודגמת בסרטון הדרכה 5. בני הזוג. ברברה Bohne וגארי הרדינג באוניברסיטת וושינגטון עשו כמה שינויים חשובים בשיטה זו. בגרסתם של שיטת ההר השלמה השבלול, העצם הטמפורלית היה נטול הסידן, משובץ בפלסטיק, וחמישה וחצי או עשרה סיבובים רבע תור היו dissecטד 6,7. ד"ר צ'רלס ליברמן ועמיתיו באיטון מעבדות פיבודי, מסצ'וסטס עין ואוזן המרפאה, השינוי בטכניקה זו, כך שהטבעת הפלסטיק לא נדרשה 8. שינוי נוסף של הטכניקה התרחש במעבדה של ד"ר ג'יאן זואו בבית החולים למחקר סנט ג'וד 9-12 שהודיע לשיטה לנתיחה שהוצגה כאן. אנו משתמשים באסטרטגיה שונה כדי לקבל גישה לאיבר של קורטי מאשר Bohne וליברמן, המאפשר בידוד של הפסגה מלאה, אמצע, וסיבובים בסיסיים. כך הרקמה גזור היא גדולה יותר ופחות סיכוי להיות אבד או ניזוק במהלך תהליכי הנתיחה או immunostaining. בנוסף, השיטה הנוכחית מאפשרת מדידה של המרחק מקצה הקודקוד או הוו בסיסי לזיהוי אזור תדר.
למרות שמעבדות רבות לבצע immunostaining של רקמת שבלול, לא ברור היכן מקורו בשיטה זו. כתוצאה מכך יש מתכונים שונים לחסימת buffeRS ומאגרי דגירה נוגדן שעשוי להשפיע על הביצועים של נוגדנים ראשוניים בודדים. כאן, אנו מציגים שיטה אחת לimmunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently שחל על נוגדנים הנפוצים ביותר בתחום השמיעתי.
הצורה המורכבת של השבלול, המבנה עדין של האיבר של קורטי, וההסגר גרמי לספק אתגר לניתוח היסטולוגית וביוכימיים. מגוון של טכניקות משמש כיום בתחום השמיעה להתגבר על התכונות קשות האלה ולדמיין את התאים בתוך האיבר של קורטי, כל טכניקה עם יתרונות משלה וחסרונות. הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר לנתיחה הר שלמה של שבלול העכבר הבוגר ו, עם שינוי קל, עלול לשמש כדי לבחון מבנים הקריטיים בתוך cochleae ממגוון רחב של אורגניזמים מודל אחרים המשמשים בתחום.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר צעדים קריטיים לנתיחה מוצלחת כל ההר וimmunostaining. עם זאת, לפני אחת מהשיטות הבאות מבוצעות, יש צורך בקיבוע הנכון של רקמת השבלול. אנו ממליצים על שימוש בכיתה ללא תשלום, אולטרה-טהורה, EM PFA מתנול. PFA עשוי אבקה יכולה להיות עקבות של מתנול ו- pH יציב אשר מקטין את האיכות של im…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).
Materials
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC –wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48 well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8 well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
Riferimenti
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. . Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters’ cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
