This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.
אחת תצפיות המגרה ביותר באבולוציה צמח הוא מתאם בין המופע של שדה המגנטי של כדור הארץ (GMF) היפוכים (או טיולים) וברגע של הקרינה של מכוסי זרע. זה הוביל להשערה כי שינויים בקוטביות GMF עשויים לשחק תפקיד בהתפתחות צמח. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק השערה זו על ידי חשיפת thaliana ארבידופסיס להתהפך באופן מלאכותי תנאי GMF. אנחנו השתמשנו במגנטומטר שלושה צירים ונתונים שנאספו שמשו לחישוב הגודל של GMF. שלושה ספקי כוח DC היו קשורים לשלושה זוגות סליל הלמהולץ ונשלטו על ידי מחשב כדי לשנות את תנאי GMF. צמחים גדלו בצלחות פטרי נחשפו לשני נורמלים והתהפכו תנאי GMF. ניסויי חשיפה שאם גם בוצעו. צמחים חשופים צולמו במהלך הניסוי ותמונות נותחו כדי לחשב אורך שורש ואזורי עלה. רנ"א הכל ארבידופסיס הופק וכמוניTime-PCR האמיתי (qPCR) ניתוחים בוצע על ביטוי גנים של CRUCIFERIN 3 (CRU3), protein1 תחבורת נחושת (COTP1), חיזור Responsive תמלול Factor1 (RRTF1), פה Superoxide Dismutase 1,, Catalase3 (cat3) (FSD1), Thylakoidal Ascorbate Peroxidase (TAPX), Ascorbate cytosolic Peroxidase1 (APX1), ו- D NADPH / נשימה חלבון מונואמין הפרץ (RbohD). ארבעה גני התייחסות שונים נותחו לנרמל את תוצאות qPCR. הכי טוב של ארבעה גנים נבחר והגן היציב ביותר לנורמליזציה היה בשימוש. הנתונים שלנו מראים בפעם הראשונה שיש היפוך קוטביות GMF באמצעות סלילי triaxial השפעות משמעותיות על גידול צמחים וביטוי גנים. זה תומך בהשערה כי היפוך GMF תורם לגרימת שינויים בהתפתחות צמח שעשוי להצדיק לחץ סלקטיבי גבוהה יותר, סופו של דבר מוביל לעמהאבולוציה Lant.
השדה המגנטי של כדור הארץ (או באופן שקול השדה המגנטי של כדור הארץ, GMF) הוא גורם סביבתי שאין מנוס לכל יצורי חיים על פני כדור הארץ, ובכלל זה צמחים. GMF תמיד היה תכונה טבעית של כדור הארץ, ולכן במהלך אבולוציה, כל יצורי החיים חוו את פעולתה. גוף הולך וגדל של ראיות מראה כי GMF הוא מסוגל להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים 1. GMF אינו אחיד ויש הבדלים מקומיים משמעותיים בגודל והכיוון שלה על פני השטח של כדור הארץ. GMF בשטח של כדור הארץ מציג מגוון רחב של גדלים, החל מפחות מ -30 μT לכמעט 70 μT. GMF מגן על כדור הארץ והביוספרה מההשפעות הקטלניות של רוח שמש על ידי הסטה ביותר של החלקיקים הטעונים שלה באמצעות המגנטוספירה 2.
צמחים מגיבים לגירויים סביבתיים; ותגובות קלאסיות לגורמי א-ביוטי כגון אור וכוח משיכה היו לאתאר horoughly על ידי הגדרת התגובות שפנה אל האור וgravitropic מה שנקרא. מעט מאוד, או לא כלום, ידוע על המנגנונים של תפיסה ותגובות של צמחים לשדות מגנטיים, למרות שפע של מאמרים שפורסמו בנושא זה ולאחרונה בביקורת 1. בניגוד לשדה הכבידה, GMF השתנה באופן עקבי במהלך האבולוציה צמח ובכך מייצג את גורם לחץ אביוטי חשוב שכבר לאחרונה נחשב לכוח מניע פוטנציאל סופו של דבר תורם לגיוון ולשתול התפצלות 2. תהפוכות גאומגנטית (או טיולים) הם שינויים בקוטביות של GMF. במהלך החיים ההיסטוריה של כדור הארץ, היפוכי GMF התרחשו מספר פעמים. אלה חשפו את כדור הארץ לתקופות של כוח GMF המופחת במהלך כל מעבר קוטבי. חלק מהחברים העלו את השערת שתקופות מעברים אלה של כוח GMF הנמוך אולי אפשרו קרינה מייננת מהרוח השמש להגיע אל פני כדור הארץ, וכך גורמותלחץ עקבי באורגניזמים חיים, שיכול היה להיות חזק מספיק כדי לגרום לשינויים גנטיים סופו של דבר מוביל להתפתחות לשתול 2.
ניתוח מפורט של ניסויים המתארים את ההשפעות של שדות מגנטיים על צמחים מציג מספר גדול של דיווחים סותרים, המתאפיינים במחסור במנגנוני האינטראקציה biophysical מתקבלים על הדעת. ניסויים רבים הם פשוט לא מציאותיים, בעוד שאחרים חסרי השערה ניתנת לבדיקה וסופו של דבר, אינם משכנע 3. בשנים האחרונות, ההתקדמות ומעמדו של מחקר על ההשפעה של שדות מגנטיים על צמח נבדקו 2,4-11. לאחרונה, את ההשפעה של שדה המגנטי הן נמוך וגבוה כבר דנה ביסודיות 1, עם דגש מיוחד על מעורבותם של אירועי היפוך GMF במפעל אבולוציה 2.
האמצעי הישיר ביותר על מנת לבסס את ההשערה כי תהפוכות GMF להשפיע אבולוציה צמח היא לסנתז GMFהיפוך במעבדה על ידי בדיקת התגובה של צמחים לתנאי שדה מגנטיים רגילים והפוכים. כדי לבדוק את ההשערה, שנבנינו לכן מערכת triaxial מתומן הלמהולץ סליל-זוגות שדה מגנטי פיצוי (סלילי triaxial), אשר מסוגל להפוך בצורה מדויקת את תנאי GMF נורמלים.
השתמשנו thaliana ארבידופסיס כצמח מודל ובדקנו את ההשפעה של GMF התהפך על ביטוי גנים של כמה גנים חשובים: CRUCIFERIN 3 (CRU3), שמקודדת חלבון אחסון 12S זרע שהוא טירוזין-פוספורילציה ומדינת זירחון שלה היא מווסתת בתגובה לABA בזרעי thaliana ארבידופסיס 12,13; נחושת התחבורה Protein1 (COTP1), שמקודד חלבון superfamily תחבורה כבדה מתכת / ניקוי רעלים עם הפונקציה העיקרית באדמת רכישת Cu ופיתוח אבקת 14; ומגיב תמלול Factor1 חיזור (RRTF1),שמקודד חבר של תת-משפחת B-3 ERF (גורם תגובת אתילן) של משפחה גורם שעתוק ERF / AP2 שמכיל אחד תחום AP2 המאפשר שיתוף ההפעלה סינרגיסטי של מסלולי ביטוי גנים ומעניק סובלנות צלב לאביוטי ויוטיים מדגישים 15.
יתר על כן אנחנו גם ניתחנו חמישה גנים המעורבים בתגובות דחק חמצוני: Fe Superoxide Dismutase1, (FSD1), שמקודד אנזים cytoplasmic כי אנזימים ומהירות ממיר את אניון סופראוקסיד (O 2 -) ומים (H 2 O) למי חמצן (H 2 O 2) וחמצן מולקולרי (O 2) 16; Catalase3 (cat3), שמקודד ואנזים שמזרז את הפירוק של H 2 O 2 למים וחמצן 17,18; Thylakoidal Ascorbate Peroxidase (TAPX), שמקודד peroxidase תילקואיד chloroplastic שscavenges H 2 O2 19; Ascorbate Peroxidase1 (APX1), שמקודד peroxidase cytosolic שscavenges H 2 O 2 ומייצג את אחת מהמטרות הפוטנציאליות של שינויים לאחר translational בתיווכו של מולקולות נגזרות-NO 20; וD חלבון מונואמין פרץ הנשימה NADPH- (RbohD) שמקודד אנזים שיוצר O 2 – וממלאים תפקידים מרכזיים בויסות צמיחה, פיתוח ותגובות דחק בארבידופסיס 21.
המתודולוגיה שדה-ההיפוך שלנו מספקת את ההוכחה הראשונה שהיפוך GMF יכול לגרום לשינוי משמעותי בביטוי המורפולוגיה וגן של א ' שורשי thaliana ויורה. פרוטוקול זה מספק דרך חדשנית כדי להעריך את ההשפעה של היפוך GMF על מורפולוגיה צמח וביטוי גנים וניתן להשתמש בם כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של היפוך GMF בהיבטים אחרים של צמח התנהגות, ובכך להנחות את הדיון בrole של היפוך GMF על התפתחות צמח.
לאחרונה הראו כי מתאם מדהים קיים בין היפוכי GMF והזמן שבו הסחת דעת של רוב השושלות משפחתי angiosperm התרחשה 2. עם זאת, למרות השערות המגרה והשפע של מחקרים על ההשפעה של עוצמות GMF מגוונות, בהנחה שההיפוך GMF עלול לגרום לעצמו לשינויים משמעותיים בביטוי גני צמח ומורפולוגיה מעולם לא הפגין. כאן אנו מראים בפעם הראשונה, שיטה המשתמשת בסליל הלמהולץ מתומן triaxial להפוך GMF במעבדה שלנו, ושההיפוך של השדה המגנטי הסביבה יכול לגרום לשינויים ואפנון של ביטוי גנים בצמחי פנוטיפי.
על מנת לקבל היפוך GMF (או שינוי) על נפח מספיק לניסויי גידול צמחים (2 x 2 x 2 מ '3), שנבנינו מערכת סליל הלמהולץ מתומן. מערכת זו אינה זמינה באופן מסחרי (בדרך כלל סלילי הלמהולץ טבעת בצורת יותר ויותר)ואת העלויות לבנייה היו ניכרות. חשוב לציין, מערכת זו מספקת שינוי שדה חזק, עם זמן-יציבות יוצאת דופן והומוגניות בשדות המגנטיים שונה.
המערכת תוכננה ונבנתה כדי להפחית את הערך של GMF לאלפית התנאים הרגילים או להפוך כל אחד משלושת הממדים של השדה המגנטי. עם זאת, העיצוב של הסלילים אינו מאפשר לייצר עוצמת שדה מגנטית גבוהה. לכן, מכשיר זה במתכונתו הנוכחית אינו מתאים לניסויים שנועדו להעריך את ההשפעה של עוצמת שדה מגנטית גבוהה בצמחים או אורגניזמים אחרים.
במעבדה, שינוי של GMF דומה לאלה שתוארו בשיטה זו הושג על ידי שיטות שונות, כולל מיגון על ידי הסובב את האזור הניסיוני על ידי צלחות פרומגנטי מתכת עם חדירות מגנטיות גבוהות, החורגת שדות מגנטיים ולרכז אותם במתכת עצמה. היתרון של שימוש בדואר סלילי הלמהולץ הוא שהמערכת מאפשרת צמחים להיחשף ליותר תנאים טבעיים (אור, זרימת אוויר, וכו '), ובכך הופך אותו אידיאלי לא רק ללימודים במבחנה (כמו בשימוש בצלחות פטרי), אלא גם לin vivo גידול צמחים וניסויי פיתוח. הממדים של המערכת שלנו ליצור מרחב המאפשר דיכוי עד <1 / ה -1,000 של GMF הטבעי לאורך 25 x 25 x 25 סנטימטר 3 נפח כדורי (ראה איור 1 א), ובכך מאפשרים לארח מספר צלחות פטרי או כמה קטנה סירים לגידול צמחים.
השיטה המוצגת כאן יושמה ללימודי ביולוגיה צמח; עם זאת, המערכת מאפשרת מגוון רחב של ניסויים, כולל ירולוגיה ומיקרוביולוגיה, כמו גם מחקרים על נמטודות (למשל, elegans Caenorhabditis), פרוקי רגליים ובעלי חיים קטנים (כוללים עכברים וחולדות). לכן, בדיקות של השערת היפוך זה של GMF הוא מסוגלכדי לגרום לשינויים מורפולוגיים ותעתיק גם יכולים להתארך עד רבות מערכות חיים אחרות, אולי סופו של דבר גם לתאים אנושיים.
GMF משתנה כל הזמן ומשתנה. לכן, בניסויים שלנו אתגר אחד גדול הוא לספק פיצוי קבוע של GMF על מנת לקבל את ערכי GMF החדשים הרצויים. זו יכולה להיות מושגת רק על ידי שליטה רציפה של ערכי שדות מגנטיים באמצעות קריאה של ערכי מגנטומטר ופיצוי מתח. לכן, המערכת יכולה לפצות חלק משתנה לאט של GMF אבל זה לא עושה כלום לתנודות בתדירות גבוהות יותר.
לסיכום, השימוש בסלילי triaxial להפוך את וקטור GMF סייע להוכיח כי היפוך זה של וקטור GMF הוא מסוגל לגרום לשינויים מורפולוגיים צמח וביטוי גני ההפרש. התוצאות שהתקבלו בשיטה שהוצגה לספק ראיות משכנעות לתמיכה בהשערה כי מחדש GMFversals אולי היה אחד הכוחות המניעים להתפתחות צמח על לוחות זמנים גיאולוגיים 2.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).
three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Ethanol | Sigma | 2860 | |
GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
Petri dish square (120×120) | Sigma | Z692344 |