Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
הבנת המנגנונים שבאמצעותם חלבוני קרום למלא הפונקציה הסלולרית שלהם לעתים קרובות יכולה להיות משימה מאתגרת, משום שדרך פעולתם שלהם לעתים קרובות הוגדרה על ידי אינטראקציות זיקה נמוכות, שקשה לזהות ולהעריך על ידי שיטות קונבנציונליות ביוכימיים. חלבוני קרום עשויים להיות כמו כן מועשרים בתחומים ספציפיים קרום 5,6 או ליצור מבנים מסדר גבוהים יותר דינמיים, שיכול בעיקרון לשנות את פעילותם הביולוגית 7.
כך מיקרוסקופ פלואורסצנטי מולקולה הבודד בסיוע לייזר לא פולשני הפך את המתודולוגיה של בחירה ללמוד חלבון התנהגות בסביבות סלולריות מורכבות. זה נכון במיוחד לתהליכים ביוכימיים המתרחשים בקרום הפלזמה, כמו אלה יכולים בעיקרון להיות במעקב בהשתקפות סה"כ הפנימית מופחת רעש מצב (TIRF). כאן תאורת מדגם מוגבלת לעד 200 ננומטר-דק פרוסה בקרבת זכוכית surface, שתוצאתה אובדן משמעותי ברקע סלולרי ו, בשל המאפיינים של אור עירור חלוף, גם בגידול משמעותי בעוצמת אות הקרינה 8,9. שני ההיבטים חשובים כאשר מכוונים לרזולוצית positional ובזמן גבוהה בזיהוי מולקולה בודד.
SLBs מישורי אינם תואם רק עם מיקרוסקופיה TIRF. כאשר פונקציונליות עם ligands המתאים הם גם מספקים גישה ישירה ללימוד הדינמיקה המולקולרית של הכרת תאי תאים כפי שהם מתרחשים בתאי מערכת חיסון או תאים אחרים. הם יכולים גם להיות פשוט מנוצלים למצב תאי ניעתי ואחרת לא חסיד קרובים מספיק לשקופית הזכוכית כך שניתן הדמיה תאים כאלה בתאורת TIRF, אשר רצויה מאוד כאשר ניסויי הולכה מעורבים מעקב מולקולה בודד או superresolution מבוסס מולקולה בודדת. לשם כך חלבונים צריכים להיות הועמסו על SLB נייד מאוד. יתרון הגלום שלי בשימוש PIDs הם שאין מחייב נוקבים של חלבונים בכל. יתר על כן, יכול להיחשב כSLBs נוזלים דו ממדים עם יכולת טבועה לרפא את עצמם; אי סדרים בתמיכת הזכוכית מתוגמלים עד מידה מסוימת. פרוטוקול צעד אחר צעד מסופק ליצור bilayers הנייד טעון עם חלבונים של עניין. ההיווצרות של SLBs מישוריים מתוארת, אשר מכילה 1-palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (POPC) כמרכיב העיקרי (90-99%) והסינטטי ופונקציונלי שומנים 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3 – {[N (5-אמינו-1-carboxypentyl) iminodiacetic חומצה] succinyl} מלח ניקל (DGS נת"ע-ניקל) בשפע נמוך (1-10%). POPC נושא חומצת שומן רוויה אחד וחומצות שומן חד-בלתי רווי אחד ויוצר bilayers שומנים גבוהים נזילות גם בRT. DGS נת"ע-Ni נקשר עם headgroup לזנבות פולי-היסטידין ומשמש כעוגן לחלבונים מתוייגים פולי-היסטידין של בחירה (איור 1).
"> חשוב לציין, חומרת מיקרוסקופיה חייבת לכלול מספר של ציוד היקפי שיתוארו להלן. עם המידע שספק וקצת ידע בסיסי באופטיקה ופיסיקה לייזר, כל ביולוג צריך להיות מסוגל לבנות התקנת הדמיה מולקולה בודדת. עירור דוגמא אידיאלי צריך להיות בוצע על מיקרוסקופ הפוכה בסכתי פנימית השתקפות מצב (TIRF) כמשטר זה מפחית אור מזויף ורקע מוגזם וכתוצאה מאחרת אוטומטי הקרינה סלולרית 9. לשם כך, מטרת TIRF-מסוגל מיוחדת (ראה להלן) ותאורת לייזר יש צורך. ניסויים מסוימים מחייבים פעמים תאורה בטווח אלפית השנייה ופעלו ברצף מהיר. כדי לחסוך זמן תאורה או להימנע מהלבנה מיותרת הנגרמת על ידי תאורה חוזרת היא לעתים קרובות מועיל לפצל את האור הנפלט לשניים או יותר ערוצי רפאים. זה מאפשר לקריאת נתונים בו זמנית של שניים או יותר פרופילי פליטה, שיכול להפוך לגורם משמעותי כאשר conducניסויי טינג מעורבים העברת פורסטר תהודת אנרגיה (סריג). הנה הפליטה כתוצאה מאחת דופק עירור אור ניתן להקליט שתי מתורם סריג וסריג acceptor (כפליטה רגישה). המצלמה צריכה ללכוד מספיק פוטונים עם רקע נמוך מספיק כדי לחזות fluorophores אחת בזמן התאורה. תוכנת מחשב תצטרך להיות לעמוד במשימה כדי לסנכרן סגירת עירור ורכישת תמונה. סקירה מקיפה היא כדלקמן ובאיור 2:מטרת TIRF-מסוגל: לתאורת TIRF מבוסס מטרת הצמצם המספרי (NA) של המטרה חייבת להיות שווה או גדול מ 1.4 באמצעות שקופיות זכוכית סטנדרטית (n = 1.515) 9. הגדלה יכולה לנוע בין 60x ל150X. המטרה צריכה להיות מתוקנת chromatically כדי לאפשר לconfocality כאשר ההדמיה fluorophores שונה.
לייזרים: מספר Lase הזמיניםאפשרויות r גדלו באופן משמעותי בשנים האחרונות. לייזרי דיודה גל מתמשך אלקטרוני modulatable מודרניים הם יעיל וחסכוניים ויכולים להיות מופעל עם תדירות ומהירות חסרות תקדים. לייזרי יון גז יקרים יותר להצטיין באיכות קרן לייזר, אבל דורשים סגירה חיצונית (ראה להלן), ולעתים קרובות נרחבים (מים) קירור.
תריסי עירור: מאפנני Acousto-אופטיים (AOM) מאפשרים סגירה מהירה ברצף מהיר 10. להדוק כיבוי השילוב של AOM עם תריסים מכאניים מומלץ. חימום בדרך זו נרחבת של AOM בשל חשיפה לאור רציף הוא נמנע והאור דולף מAOM במחוץ לעמדה מתבטל.
עדשות משמשות להרחבת קרן לייזר ולהתמקד על מישור המוקד האחורי של המטרה. בדרך זו, אור העירור עוזבת את המטרה כמו קרן מקבילה (איור 3), אשר נדרש לתאורת TIRF של המדגם. הזזת הנקודה במישור המוקד האחורי המוקד מהמרכז לפריפריה של המטרה יהיה לשנות את הזווית שבה הקרן עוזבת את המטרה, אך לא את המיקום של נקודת הלייזר בדגימה (איור 3), שהיא פונקציה של הגיאומטריה הקרן הכוללת. תאורת TIRF מתפתחת בזווית קריטית, אשר יכול להיות מותאמת באמצעות מערכת של מראות מתפקדות כפריסקופ לתרגם את נקודת לייזר מוקדי במישור המוקד של המטרה. עדשות צריכה להיות מתוקנות chromatically וניתן להשתמש בו בסט של שתיים או שלוש עדשות. מערכת של שלוש עדשה מורכבת משתי עדשות מתנהגות כמו טלסקופ להרחיב את קרן הלייזר (ומכאן נקודת ההארה בדגימה) ועדשה שלישית למקד את האלומה התרחבה למישור המוקד האחורי של המטרה (איור 4). פונקציות שני (טלסקופ והתמקדות) גם יכולות להיות מושגת על ידי שילוב של שתי עדשות בלבד (ראה איור 4).
<p class="Jove_content"> מראות צריכה להיות לפחות 95% רעיוני כדי למנוע אובדן של אור הלייזר. עבור כל התאמת קרן סט של שתי מראות מיושם בדרך כלל כהסדר כזה הוא מספיק כדי להתאים כל זווית ומיקום של קרן לייזר בדיוק.שכבות Dichroic משקפות ולהעביר אור באורכי גל שונה שצוין ומשמשות כדי להרכיב או לפצל את קורותיהם של שני לייזרים.
מסנני Polychroic הם יותר מורכבים ממסנני dichroic ויש צורך כדי לשקף את אור העירור הנכנס ולהעביר יציאת פליטת אור מהדגימה. הם ממוקמים לתוך קוביית המסנן בין המטרה ועדשת צינור מיקרוסקופ.
לנקות את המסננים: בהתאם לסוג של לייזר ד פקיד הלייזר לנקות מסננים עם רוחב פס שידור צר צריך להיות ממוקמות בקרן הלייזר מייד לאחר שהוא עוזב את הלייזר.
מסנני Notchנועד לספוג ביעילות אור הלייזר עם רוחב פס צר ולהעביר את כל האור האחר. הם ממוקמים בתוך נתיב הפליטה לסנן את כל אור עירור לייזר מזויף. עם זאת, מסנני חריץ לעבוד רק ב 0 מעלות זווית נכנסת. אם הלהקה-הרוחב של מסנן החריץ הוא חד מאוד, הזוויות השונות הנכנסות עשויות שלא תבואנה לידי ביטוי יותר. חסימה של אור לייזר לייזר collimated אינה מושפעת, אבל אור אחורי פזורים-אולי לא להתעכב ביעילות מלהגיע המצלמה.
גלגלים ממונעים מסנן מצוידים בגלגלי מסננים מתאימים ניתן למקם בקלות למסלול העירור ופליטה ומאפשרים מיתוג פשוט בין עוצמות השונות אור (כאשר מצוידים במסנני ND) או ערוצי ניאון (כאשר הוצבו מול מנורת קשת קסנון או כספית לratiometric ההדמיה סידן או בחלק הקדמי של המצלמה לבחירה לfluorophore הפולט).
50:50 קוביית מפצל קרן גלשמש לפצל קרן לייזר לשני נתיבים נפרדים קורה עירור וגם לשלב אותם בחזית של פריסקופ.
מפצל קרן (נתיב פליטה): לרכישת תמונה מהירה ללא כל צורך בשינויי מסנן פיזיים, קרן הפליטה מחולקת לערוץ-עבר כחול ואדום העביר. באופן עקרוני, ניתן לבנות מפצלי אלומה על ידי העסקת טריז dichroic או סט של מראות ומראה dichroic להפריד את קרן הפליטה באופן גל-תלוי. יש צורך בשני מסנני פליטה לנקות את הערוצים הנפלטים.
מסנן מרחבי: לפעמים סינון מרחבי של קרן העירור נדרש להסיר את קרני אור שאינו מקבילה נפלטת מקרן לייזר באיכות נמוכה. מסנן המרחבי מורכב של טלסקופ שתי עדשות עם חריר קטן ממוקם בדיוק בנקודה של שני עדשות מוקדי. אור המזויף דרך זו נובע מחלקים שאינם מקבילים של קרן הלייזר נחסם ביעילות. סותנאי CH יש לעמוד בעת הקמת מיקרוסקופיה מבוססת TIRF. עליות מרחבי סינון עם חורים קטנים יותר, שהם קשים יותר למצב לנקודת המוקד, ועם אורכי מוקד קטנים יותר של העדשה הראשונה. כדי להפחית את ההשפעות נגרמות על ידי סטיות עדשה זה יתרון להעסיק במקום עדשות פשוטות באיכות גבוהה ומטרות מיקרוסקופ-תיקן אינסוף עם הגדלה נמוכה (10x או 20x).
פריסקופ: התקנת פריסקופ יש צורך לתרגם את קרן הלייזר הממוקדת במישור המוקד האחורי של המטרה, תנאי מוקדם להדמית TIRF. ניתן לבנות אותו בקלות משתי מראות שני אינץ ', שלב translational להתאמת המראה הראשון ולאחר למיצוב המראה השני כדי לשקף התרחב והתמקד קרן עירור למיקרוסקופ (איור 5).
מצלמה: מואר חזרה התקנים (EMCCD) צמוד מטעני אלקטרונים הכפלה משמשים באופן שיגרתי לההקלטה של אותות מולקולה בודדים. סיבה לכך הוא יעילות קוונטית הגבוהה שלהם (עד 95%), מהירות רכישה גבוהה (עד 30 מגה-הרץ) ורעש נמוך יחסית. הרגעות ל-80 ° C מפחיתה רעש תרמי ונתמכת על ידי מספר המצלמות זמינות כרגע EMCCD. מגבלה של טכנולוגית EMCCD היא שרעש המצלמה מגדיל באופן ליניארי עם שני רווח המצלמה ושכבשה את האות. זה לא המקרה עם מצלמות מדעיות CMOS (sCMOS), שהם באופן משמעותי פחות יקרים ולפעול בשל הארכיטקטורה המיוחדת של שבב sCMOS גם הרבה יותר מהר מאשר מצלמות EMCCD. עם זאת בעיה הקשורים לטכנולוגית CMOS היא שרכישת התמונה עדיין חסרת מידה מסוימת של קריאת נתונים הכמותיים ברמה מולקולה בודדת, משום שכל פיקסל כולל רגישות זיהוי שונה. בעיקרון זה יכול להיות מתוגמל באמצעות הנורמליזציה פיקסל, אך הליך זה הוא בשום אופן לא טריוויאלי 11. זו הסיבה שאנחנו עדיין מהססים מחדשלשבח מצלמות sCMOS למיקרוסקופיה מולקולה בודדת, אבל לנוכח ההתפתחות המהירה של טכנולוגיה זו, מצלמות sCMOS עשויות להפוך בקרוב את המצלמה של בחירה. מצלמות איטיות מצלמות CCD סריקה להימנע שונות רעש ופיקסל הקשורים להגברה כולם ביחד ולתמוך בקצבים המהירים ביותר רכישה אם הם יכולים להיות מופעלים במצב 'קינטית "מה שנקרא. במצב זה כל שבב המצלמה פרט לאזור של העניין (ROI) הוא רעול פנים, המאפשר להעסיק את השבב עצמו כהתקן אחסון. לאחר החזר ההשקעה חשופה בפעם הראשונה, את ההאשמות וכתוצאה מכך הם עברו לאזור רעול פנים של קו פיקסל שבב על ידי קו פיקסל, שבו התמונה מוגנת מחשיפה לאור נוספת. ברגע שההסטה של כל הקווים של ההחזר על ההשקעה באזור רעול פנים הושלמה (בטווח תת-אלפית השנייה), ההחזר על ההשקעה עצמו הוא מוכן לחשיפה הבאה. מחזור זה חוזר על עצמו עד שכל קווי פיקסל של שבב CCD נזקפים. אז השבב לקרוא לאט עם ניכר reduרעש הקריאה CED. לדוגמא על שבב פיקסל 1000 x 1300, 20 ROIs של 50×50 פיקסלים ניתן להקליט ברצף מהיר. בגלל התמונות יישארו על השבב לזמן רב לפני שקראו את זה, זה קריטי כדי להבטיח מיסוך באיכות גבוהה וכדי לקרר את המצלמה (למשל עם חנקן נוזלי) כאמצעי להפחתת רעש תרמי מוגזם. כמה מצלמות EMCCD תומכות גם במצב קינטית.
תוכנה: התזמון של לייזרים, תריסים, AOMS וחשיפת מצלמה, כמו גם אחסון תמונה נכון הוא חלק בלתי נפרד לכל ניסוי הדמיה מוצלח. בעיקרון ניתן לתכנת פעולות מוגדרות רבות עם חבילות תוכנה זמינות שמגיעות עם המצלמה. חבילות תוכנה מסחריות לתמוך במספר גדול של ציוד היקפי חומרה, אשר יכול להיות מיושם עם ידע טכני קטן.
מחולל פעימות, רכישת נתונים (DAQ) לוח (עם אנלוגי וערוצי פלט דיגיטליים) ואוסצילוסקופ: מחולל פעימות היאבחירה מצוינת להמיר פולסים הדק לפולסים של זמן ומתח מוגדרים. לייזרי דרך זו ניתן לשלוט במדויק על תפוקת כוח ולמתוזמן באלפית השני לטווח תת-אלפית שנייה. לוחות DAQ עם יציאות אנלוגיות להשיג את אותה ולשלב בקלות לתוך לוח האם של המחשב דרך חריצי PCI. משך דופק, משרעת ותדירות מאומתים עם אוסצילוסקופ.
מארז של נתיב קרן עירור כל: כדי למנוע תנודות בפרופיל העירור בשל convections אוויר נתיב קרן עירור כל צריך להיות סגור מסביבת המעבדה שלו. צעד זה חשוב במיוחד בעת ביצוע מיקרוסקופיה TIRF. רכיבים אופטיים גם מוגנים מפני אבק והעין האנושית מחשיפת אור הלייזר. מארזים יכולים להיות בקלות לבנות מלוח הכרטיס שחור, שניתן לרכוש בחנויות אספקת אמנויות.
כדי לקבוע את הנזילות של שחזור SLB הקרינה לאחר Photobleacהינג מדידות (FRAP) 12 מבוצעים. לFRAP קיומם של שני נתיבי קרן עירור רצוי (ראה איור 3). נתיב הקרן הראשון נועד תמונת הקרינה של bilayer. ניתן לעשות זאת בתצורת TIRF ועם עוצמת אור נמוכה. נתיב הקרן השני צריך לאפשר לדופק אקונומיקה קצר אך אינטנסיבי וצריך להיות מוגדר באינו TIRF-מצב, כך שהוא עוזב את המטרה לאורך הציר האופטי. פתח עגול ניתן להציב לתוך נתיב קרן עירור (ראה איור 8) להקרין פרופיל אקונומיקה עגול ומושלם עם קצוות מוגדרים. על מנת תמונת צמצם זה על מטוס האובייקט, המיקום האופטימלי שלה יהיה במישור המוקד של עדשה 3 (ראה איור 3). עם זאת, בשל אורך המוקד הארוך של העדשה, תמונת צמצם באיכות מספקת יכולה גם להיות שנוצרה, כאשר הצמצם ממוקם בעמדות מעט השתנו.
לאחר שלא בוצעהוא ההדמיה ניסוי נתונים הגולמיים יש לנתח כראוי. כמה פרוטוקולי צעד-אחר-צעד מוצעים, אשר מכסים את ההתאמה של ההגדרות הראשיות (לדוגמא כוח הארה וזמן, זווית TIRF), רכישה וניתוח הנתונים.
מיקרוסקופיה מולקולה בודדת מספקת הזדמנות הייחודית ללמוד את ההתנהגות של חלבונים בסביבה הסלולרית האם שלהם. הדמיה מולקולרית הופכת אטרקטיבית יותר ויותר ולכן לקהילה מדעית רחבה, עדיין מדעני חיים רבים עדיין נרתעים מההשקעה הראשונית בטכנולוגיה ומומחיות. היתרון העיקרי הנובע מהרכבת מערכת ההדמיה של האדם עצמו הוא שזה יכול להיות מותאם בקלות לצורך הספציפי של כל אחד.
ניסויים כפי שהוצע במסמך זה אינו TIRF קרן עירור יכולה להיות מיושמת בקלות, בנוסף לנתיב TIRF אור הקיים, אם צילום הלבנת מהירה ומוגדרת (או -activation) של fluorophores וligands היא רצויה, למשל בעת ביצוע FRAP או יגנד משחררות רפרוף 14 . המבוא של מפצל קרן פליטה מאפשר הקלטה בו זמנית של לפחות שני ובמקרים מסוימים עד ארבעה ערוצי ניאון. הרשימה של סיומות היא במהות מוגבלת רק על ידידמיונו של אחד.
לדוגמא, יישום גלגל מסנן פליטה ממונע בנתיב הפליטה מאפשר מיתוג מהיר בין עד עשרה ערוצי ניאון שונים. כאשר שילוב של שני גלגלי מסנן פליטה ממונעים (כל מצויד בחריצים 10 מסנן) בסדרה, עד 18 ערוצי ניאון ניתן לקרוא את. הדמיה מבוססת TIRF יכולה להיות כהשלמה עם מדידות גיוס סידן והשתקפות הפרעות מיקרוסקופית (IRM) לאחר האינטגרציה של נתיב מנורת קסנון עירור או מרקורי. IRM הוא השיטה של בחירה כדי להמחיש את המידה שבה תאים מחוברים למשטח הזכוכית או SLB ולכן יכולים לספק מידע קריטי כאשר לפרש נתונים הדמיה מבוסס TIRF. הקמת קרן עירור התרחבה בשימוש במראה dichroic פשוט וליזר נוסף של 405 ננומטר מאפשר ביצוע מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation (PALM) או מיקרוסקופי שיקום אופטי סטוכסטיים (סערה), כלומר, שתי superresolutמתודולוגיות יון עם דיוק מיקום מתחת לגבול ההשתברות של 15,16 אור הנראה.
עם זאת, הצלחת ניסוי היא לא רק עניין של חומרה מתאימה. לקחת את מלוא יתרונות של הדמיה מבוססת TIRF מופחת רעש, תאים צריכים ליצור קשר למשטח באופן שאינו מטיל מגבלות על פני התא או שמפריע לפיסיולוגיה של קרום הפלזמה שלהם. SLBs פונקציונליות עם החלבונים מתאימים להדבקת התא עולים גם מתאימים למטרה זו, כי כל ligands המשובץ-SLB הם רוחבי ניידים ולשנות את המיקום לרוחבם בתוך bilayer בתגובה לקולט דינמיקה מחייבת והפרדה.
כדי לייצר SLBs באופנה לשחזור, עדיף להתחיל עם רכבי שטח של טוהר גבוה. כפי שתואר במסמך זה, זה כך קריטי להסרת שלפוחית multilamellar, שמיוצרים גם במהלך sonication, בשני שלבי ultracentrifugation כמו שאני אלהnterfere עם הקמתה של SLBs הרציף הכולל גבוהות נזילות. SLBs של צורה באיכות גבוהה רק על משטחי זכוכית נקיים. ברגע שיש להשתמש בשקופיות זכוכית לנקות באופן מיידי או מאוחסנות בואקום. חשוב לציין, SLBs לא חייב להיות חשוף לאוויר כמו זה יוביל לשיבושם. שטיפת SLB כרוכה, כפי שמוצג, חיץ שטיפה עם השימוש בפיפטה סרולוגיות, כמו זה הוא לא רק אבל גם הליך-חיסכון בזמן שמירה.
במהלך קציר וטיהור של חלבוני SLB-תושב יש להימנע בשימוש בחומרי ניקוי. סיבה לכך הוא חומר הניקוי יפחית באופן משמעותי את הניידות חלבון גם כאשר קיימים בכמויות זעירות. כדי לעקוף את הצורך בחומרי ניקוי כולם יחד, ביטוי מסיס של ligands מצויד תג polyhistidine מופרש מומלץ בתאי יונקים או חרקים. אם מקפל מגופי הכללת E.coli נדרש, זהירות חייבת להיות מיושמת כדי להסיר חומרי ניקוי ביעילות מהגופים ההכללה לפני בלתי ומקפל.
יתרון עיקרי של העסקת תוצאות SLBs מהטבע מודולרית וreconstitutive, המאפשר לנתח את התפקיד של אינטראקציה קולטן ליגנד ניתנה להפעלת תא והידבקות תא ספציפי. בהקשר זה חשוב להזכיר כי DGS נת"ע-Ni צריך להיות נוכח ב 10% בתוך SLB כדי למנוע חלבונים המתחרים על אתרי קישור נת"ע-NI. כאשר העסקת SLBs מחסה רק 1% או 2% DGS נת"ע-ניקל, ירידה בעמותה של מיני חלבון מתויג polyhistidine נתון יכול להיות לב, במיוחד כאשר שיתוף דוגרים הגדלת כמויות של מיני חלבון polyhistidine מתויג שני (שלא פורסם תצפית). תופעה זו לא נצפתה בעת העבודה עם SLBs הכולל 10% DGS נת"ע-ניקל.
בעוד שמעולם לא נצפו הלא ספציפי מחייב כל חלבון polyhistidine מתויג נבדק לSLBs מכיל DGS נת"ע-ניקל, אפשרות זו צריכה להיבדק בעת השקת חלבון בפעם הראשונה,לשם כך אנו ממליצים על השימוש בSLBs נטול DGS נת"ע-ניקל (החלבון לא צריך לקשור). שנית, בעת השימוש בSLB מכיל DGS נת"ע-ניקל, החלבון צריך לבוא לגמרי לאחר שטיפת SLB עם PBS המכיל 300 מ"מ imidazole.
יתרון משמעותי נוסף של העסקת SLBs הוא שאינטראקציות חולפות ואירועי איתות יכולות להיות במעקב עם הרזולוציה spatiotemporal המשופרת 17-19. זה לפחות בחלקו, כי תהליך מחייב שלושה ממדים מצטמצם בעצם לשני ממדי הדמיה, במיוחד בעת הקלטה במצב TIRF רעש-מוחלש. השימוש בSLBs תואם זיהוי אות מולקולה בודדת, תנאי מוקדם למיקרוסקופיה מופעלת תמונה לוקליזציה (PALM) או סטוכסטיים מיקרוסקופיה שיקום האופטית (סערה), כלומר מיקרוסקופיה superresolution עם רזולוציה מתחת לגבול ההשתברות 15,16. שיטות הדמיה מיוחדות אלה מאפשרים מולקולה בודדת פורסטר תהודת האנרגיה Traניסויי nsfer נועדו להמחיש אינטראקציות חלבון-חלבון בודדים בסביבה הסינפטי 20. גישה זו מוסברת בפירוט רב בפרסום יופיטר נקרא "מדידת TCR-pMHC מחייב באמצעות assay מיקרוסקופיה מבוסס סריג" 21.
כאשר לפרש ניסויים מבוססי SLB אחד תמיד צריך לזכור שלא כל התכונות של קרום פלזמה של תא חי הם הוצגו על ידי SLBs, וכי חלק מהתכונות חסרות עלול להשפיע על הפיסיולוגיה תחת חקירה. אחרי הכל, חלבונים משובצים-SLB באופן חופשי לשדר ואינו מאורגנים בmicrodomains קרום כמו רוב העמיתים הסלולריים שלהם הם 5,6,22. גיליונות קרום פלזמה משותקת נגזרים מהתאים חסיד, אשר לחסוך בארכיטקטורת קרום פלזמה של תאי חיים במידה מסוימת, כבר מועסקים בהצלחה ללמוד את הספיגה מאנטיגנים-מוטבע קרום על ידי B-23 לימפוציטים. עם זאת, גם כזהקרומים לא אינטראקציה עם שלד תא דינמי מאוד וכוללים לא גמישות כפי שהם נתמכים על ידי משטח זכוכית נוקשה. לאור פערים אלה קיימים באופן ברור צורך בSLBs הנדסה, אשר מציעים אמצעים למדר חלבונים באופן מוגדר ואשר נתמכים על ידי משטחים של גמישות להתאמה או על ידי משטחים המשנים הקשיחות שלהם בתגובה להבזקי אור מיושמים באופן מקומי.
The authors have nothing to disclose.
תואר שני נתמכה על ידי מענק של שרדינגר קרן המדע האוסטרי (FWF, J3086-B11) ותודה מקס פלנק-החברה לתמיכה כספית ומנהלית. GS נתמכה על ידי קרן המדע והטכנולוגיה וינה (WWTF, LS13-030). JH נתמכה על ידי קרן המדע והטכנולוגיה וינה (WWTF, LS14-031).
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |