Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
Массивные диафизарные костные дефекты являются большой проблемой для хирурга-ортопеда. замене кости с аутогенной костного трансплантата, в настоящее время рассматривается как золотой стандарт лечения, в ограниченном количестве и связано с уборочной, связанных с заболеваемостью. По этим причинам, тканевой инженерии кости конструкции, сочетающие костного мозга мезенхимальных стволовых клеток с остеокондуктивном матриксе были исследованы в качестве альтернативы для аутотрансплантатов в ортопедической хирургии.
На сегодняшний день, большинство исследований были проведены в клинически соответствующих моделях животных , таких как собаки, свиньи и овцы 1-3, но предварительная оценка этих конструкций в ортотопических, сегментарный, критического размера костных дефектов в моделях небольших животных (например , мышей) может иметь несколько преимуществ: (I) низкие затраты, (II) большое количество животных можно управлять; (III), в отличие от крупных животных моделях, гомогенность линий мышей ограничивает индивидуальные вариации в каркасного резорбции Aформирование й кости и; (IV) самое главное, наличие специфических антител и ген-направленных животных позволяют оценку биологического процесса, участвующих в лечении костей. И последнее, но не в последнюю очередь, использование иммунодефицитных штаммов мышей позволяет также исследования с использованием либо трансплантатов или клетки человеческого происхождения без неблагоприятных иммунных реакций у мышей.
Несмотря на вышеупомянутые преимущества, массивные диафизарные модели дефекта кости у мышей немногочисленны. Большинство таких моделей используют фиксацию костной ткани с интрамедуллярной штифтом, заполняющей полость костного мозга (ограничивая тем самым объем материала, подлежащего испытанию) , а также препятствует воспроизводимости, не обеспечивая вращения и осевую устойчивость 2,4-7.
Целями данного исследования являются: (I) изображая клинический костный несоюзных ситуацию, чтобы описать воспроизводимый, критический величину, сегментарный, бедренную модель дефектов у мышей, которая стабилизируется точной и воспроизводимой замок пластины osteosynthтеза , что обеспечивает высокую стабильность биомеханической среды 8-10; (II), для иллюстрации настоящего модель с двумя потенциальными заменителями костной ткани и для описания формирования кости анализов, которые могут быть использованы.
Внематочная имплантации ортопедических связанных материалов и устройств на мышах обычно проводится для оценки кости , образующую потенциала различных каркасах 13,14. Важные различия, однако существуют между внематочной и ортотопической модели, в том числе родных факторов остеогенной сигнализации и паракринной взаимодействия с принимающими кости клеток, образующих.
Настоящее исследование устанавливает воспроизводимый мышиный большой сегментарный, критический размер бедренной кости дефект (3,5 мм, примерно 20-25% от длины бедренной кости). Учитывая размер такого дефекта и стабильности, обеспечиваемой в результате пластины остеосинтеза, эта модель имитирует клинически попавшееся атрофический кости несоюзных.
Послеоперационный период времени выбран в настоящем исследовании, в соответствии с описанными ранее не союзные модели мышей, демонстрируя отсутствие адекватного исцеления после 8 до 12 недель 4,9,15,16.
Самое главное, что reproduCible и стабильный остеосинтез, а также стабильность имплантированных заменителей костной ткани , были получены без значительной заболеваемости и смертности 1,2 с использованием как крепежного элемента и зажимного приспособления для выполнения ostectomy. Этот результат контрастирует также результаты сообщили , когда либо внешний фиксатор или остеосинтеза были использованы 4,5,17-24. Для внешних фиксаторов потенциальных К недостаткам можно отнести: изменчивость в жесткости, инфекции штырьки путей, ослабив штифтов, потенциалы травм из-за булавок и веса материалов (от 4 до 20% от массы тела мыши). Для остеосинтеза потенциальные недостатки включают в себя: заполнение костномозговой полости с ногтем и ятрогенного повреждения суставных поверхностей.
Другие мышиные сегментные, критического размера бедренные дефекты , стабилизированные пластины остеосинтеза были описаны с дефектом кости , созданного заусенца и в пределах от 1,5 до длины 16,25 2 мм. В гое настоящая модель, использование джиг и пильного проволоки позволило точную 3,5 мм длиной ostectomy без существенных мышц травмы.
Однако, чтобы добиться успеха в выполнении процедуры следует взять на себя внимание несколько ключевых моментов: Не используйте маленький мышей (голых мышей, либо с весом до 25 г или в возрасте до 8 недель) в противном случае пластина должна быть слишком длинным. При приближении к бедренной кости, заботиться о сохранении как седалищного нерва каудально и суставной капсулы дистально. Нанесите пластину на передней стороне бедренной кости, и так как выравнивание пластины определяется применением этого первого винта, позаботиться, чтобы расположить пластину параллельно бедренной кости при вставке этот первый винт.
Перед тем как сделать ostectomy, позаботиться, чтобы выполнять круговое рассечение бедренной кости в середине диафиза, чтобы избежать мышечной травмы. При выполнении ostectomy, помощник хирурга должен твердо держать направляющую и СурGeon должен быть осторожным (я), чтобы не зацепить пильной проволоки, (б) использовать средние две трети проволоки при применении постоянного устойчивую напряженность, и (III), чтобы избежать избыточного движения, чтобы получить прямой разрез кости.
Кость исцеление возможно в данной модели при условии, используется костный трансплантат. Кроме того, эта модель позволяет дальнейшие исследования механизмов, участвующих в стратегии замены кости, когда либо человеческого происхождения-трансплантаты или клетки используются в хорошо стандартизированной, большой, сегментарной, костный дефект.
Кроме того, в соответствии с современными тенденциями , требующих уточнения и сокращение использования животных в ортопедии , связанных с исследованиями, эта модель может быть использована в сочетании с методами визуализации в естественных условиях , таких как биолюминесценции. Такие неинвазивные методы позволяют мониторинг как имплантированный выживаемость клеток и заживление тканей , не требуя жертвоприношения животных 26.
Основные ограничения данной модели являются какУсловия несущие и объем костного дефекта, созданного, потому что они не полностью имитируют те, которые встречаются клинически в организме человека. Другие ограничения модели (я) радио-помутнение пластины , которая может потребовать удаления пластины перед тем экс естественных условиях μCT анализа и может осложнить интерпретацию продольных рентгенографических результатов обследования и, (б) невозможность модулировать пластины жесткости , которая может быть ключевым параметром механического в формировании костной ткани 27-30.
Следует иметь в виду также, при использовании либо кости изотрансплантат или другие каркасы, содержащие минеральные компоненты (в частности, карбонат кальция), что некоторые смещения введены в процессе сегментации анализа микро-КТ, потому что новообразованный плотность костной ткани частично перекрывается либо плотность изотрансплантат или плотность строительных лесов. По этой причине объем кости получить путем анализа микро-КТ в основном отражают объем минерализованные ткани (новообразованной кости плюсзаменитель костной ткани) 11,26,31.
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность Rena Bizios за ее ценные замечания по рукописи.
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |