Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
defeitos ósseos da diáfise maciças são um grande desafio para o cirurgião ortopédico. substituição óssea com enxerto ósseo autólogo, actualmente considerado como o tratamento padrão-ouro, é em quantidade limitada e está associada com morbidade relacionada à colheita. Por estas razões, as construções de engenharia de tecidos ósseos combinando medula óssea as células estaminais mesenquimais com andaimes osteocondutoras têm sido explorados como uma alternativa para os auto-enxertos em cirurgia ortopédica.
Até à data, a maioria dos estudos foram realizados em modelos animais clinicamente relevantes, tais como cães, porcos e ovelhas 1-3, mas a avaliação preliminar destas construções em segmentadas, defeitos ortotópicos ósseos de tamanho crítico em modelos de pequenos animais (como ratinhos) pode ter diversas vantagens: (i) as despesas baixas, (ii) um grande número de animais pode ser operado; (III), em contraste com modelos animais de grande porte, a homogeneidade das estirpes de ratinho limita variações individuais na reabsorção um andaimend formação óssea e; (Iv) o mais importante, a disponibilidade de anticorpos específicos e animais de gene alvo possibilitar a avaliação do processo biológico envolvido na cicatrização óssea. Por último, mas não menos importante, o uso de estirpes de ratos imunodeficientes de também permite estudos utilizando quer enxertos ou células de origem humana, sem respostas imunes adversas em ratinhos.
Apesar das vantagens acima mencionadas, enormes modelos defeito ósseo da diáfise em camundongos são escassos. A maioria de tais modelos utilizam fixação do osso com uma cavilha intramedular que preenche a cavidade da medula óssea (que limita o volume de material a ser testado) e também impede reprodutibilidade, não fornecendo estabilidade rotacional e axial 2,4-7.
Os objectivos do estudo são (i) imitando uma situação óssea clínica não-união, para descrever uma, de tamanho crítico reprodutível, segmentar, modelo de defeito femoral em ratos, que é estabilizado por osteosynth bloqueio de placa preciso e reprodutívelESIS que fornece um ambiente biomecânico altamente estável 8-10; (Ii) para ilustrar o presente modelo com dois potenciais substitutos de osso e para descrever analisa a formação do osso que podem ser utilizados.
Implante ectópico de materiais e do dispositivo em ratinhos ortopédicos-relacionada é normalmente realizada para avaliar a formação de osso capacidades de diversos suportes 13,14. no entanto existem diferenças importantes entre os modelos ectópica e ortotópicos, incluindo fatores de sinalização osteogênico nativas e interações parácrinos com células formadoras de osso hospedeiro.
O presente estudo estabelece uma grande segmentar murino reprodutível, de tamanho crítico defeito femoral (3,5 mm, aproximadamente 20-25% do comprimento do fémur). Considerando o tamanho de tal defeito e da estabilidade proporcionada pela osteossíntese placa resultante, este modelo imita a não união óssea atrófica clinicamente encontrado.
O período de tempo pós-operatório escolhido no presente estudo, está em linha com ratos modelos não-sindicalizados descritos anteriormente, mostrando uma falta de cicatrização adequada após 8 a 12 semanas 4,9,15,16.
Mais importante ainda, reproduCIBLE e estável osteossíntese, bem como a estabilidade dos substitutos de osso implantados foram obtidos sem a morbidade e mortalidade significativas 1,2 com o uso de ambas as placas de bloqueio e um gabarito para executar a osteotomia. Este resultado contrasta também os resultados relatados quando qualquer um fixador externo ou uma haste intramedular foram utilizados 4,5,17-24. Para os fixadores externos potenciais desvantagens incluem: variabilidade na rigidez, infecções dos tratos pinos, afrouxamento dos pinos, os potenciais lesões devido aos pinos e o peso dos materiais (4 a 20% do peso corporal do rato). Para o prego intramedular potenciais desvantagens incluem: enchimento da cavidade medular com a unha e iatrogénica danos das superfícies articulares.
Outros segmentares murino, crítico-size defeitos femorais estabilizados por placa de osteossíntese têm sido descritos com defeito ósseo criado por uma rebarba e que varia de 1,5 a comprimento de 2 mm 16,25. em the presente modelo, a utilização de um gabarito e um fio de serra permitiu uma osteotomia de 3,5 mm de tempo preciso, sem músculos significativas trauma.
No entanto, para ter sucesso na realização do procedimento deve-se levar em consideração vários pontos-chave: Não use pequena ratos (camundongos Nude com qualquer um peso inferior a 25 g ou idade inferior a 8 semanas) caso contrário, a placa deve ser muito longo. Ao aproximar-se do osso femoral, ter o cuidado de preservar tanto o nervo ciático caudal e da cápsula articular no sentido distal. Aplicar a placa na face anterior do osso femoral e uma vez que o alinhamento da placa é determinado pela aplicação deste primeiro parafuso, ter o cuidado de posicionar a placa paralela ao fémur ao inserir este primeiro parafuso.
Antes de fazer a ostectomy, ter o cuidado de realizar uma dissecção circular do fêmur no meio da diáfise para evitar trauma muscular. Ao realizar a osteotomia, o assistente do cirurgião deve segurar com firmeza o guia eo surGeon deve ter cuidado (i) não emaranhado do fio de serra, (ii) utilizar as médias de dois terços de fio durante a aplicação de uma tensão constante e regular, e (iii) para evitar o excesso de movimento para obter um corte do osso linear.
a cura do osso é possível, no presente modelo proporcionado um enxerto ósseo é usado. Além disso, este modelo permite estudos posteriores dos mecanismos envolvidos nas estratégias de substituição óssea quando tanto enxertos ou células de origem humana são utilizados num grande, segmentar, defeito bem padronizado, osso.
Além disso, de acordo com as tendências atuais que exigem refinamento e redução do uso de animais em pesquisas relacionadas à ortopedia, este modelo pode ser usado em conjunto com in vivo técnicas de imagem como bioluminescência. Tais técnicas não invasivas permitem o monitoramento tanto a sobrevivência das células implantadas e cicatrização do tecido sem exigir o sacrifício de animais 26.
As principais limitações do presente modelo são tanto ocondições de suporte de carga e o volume do defeito ósseo criada porque não imitar completamente aquelas encontradas clinicamente em humanos. Outras limitações do modelo são (i) a rádio-opacidade da placa que podem exigir a remoção da placa antes da análise ex vivo μCT e pode complicar a interpretação dos resultados do exame radiográfico longitudinais e, (ii) a incapacidade de modular a placa de rigidez que pode ser um parâmetro mecânico chave na formação do osso 27-30.
É preciso ter em mente, também, ao usar isoenxerto osso ou outros suportes que contêm um componente mineral (especificamente carbonato de cálcio), que algum viés são introduzidas no processo de segmentação da análise micro-CT, porque a densidade óssea recém-formado, em parte, sobreposto com quer a densidade isoenxerto ou densidade andaime. Por esta razão, o volume ósseo obter por meio da análise de micro-CT reflectem principalmente o volume de tecido mineralizado (osso recém-formado maissubstituto ósseo) 11,26,31.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a Rena Bizios por seus valiosos comentários sobre o manuscrito.
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |