Вывод для взрослых фибробластов человека и их прямое преобразование в расширения нейронной клетки-предшественники

В 2006 году Яманака и его коллеги смогли показать, впервые возможность перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентных государства ^1. Это дедифференцировка было достигнуто гиперэкспрессией четырех факторов транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и C-Мус в мышиных фибробластов. Сформированные так называемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) показывают функциональную эквивалентность эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и, таким образом, могут быть дифференцированы во все типы клеток взрослого организма. Один год спустя перепрограммирования для ИПСК также может быть достигнуто за фибробластов человека ^2. Эксперименты на животных моделях показывают, что Ipsc-клеток, полученных как правило, могут быть использованы для клеточной терапии замены, например, в болезни Паркинсона (PD) ^3-5. Тем не менее, некоторые ограничения, связанные с использованием ИПСК представляют препятствия для полной реализации их терапевтического потенциала. Прежде всего, перепрограммирования клеток в плюрипотентные состоянии и последующееКонтроль качества, как правило, отнимает много времени и неэффективный процесс уступая в обширных и, таким образом, дорогостоящие процедуры для культивирования клеток. Во-вторых, иПСК должны быть повторно дифференцировать в нужный тип клеток, представляющих интерес до биомедицинского применени, и вероятность остаточных клеток плюрипотентных в дифференцированной популяции таит значительную онкогенного потенциала и, таким образом, показывает высокий риск после трансплантации клеток ^6. В-третьих, процесс перепрограммирования, как правило, достигается путем индукции факторы перепрограммирования lenti- или ретровирусной инфекции. Интеграция этих вирусов в геном хозяина, может привести к инсерционного мутагенеза и / или неконтролируемого реактивации трансгенов ^7,8. Номера интегративные системы были разработаны для обеспечения факторы перепрограммирования в клетки-мишени, которые минимизируют риск инсерционного мутагенеза и трансгенной реактивации. Примерами таких трансгенных свободной подходов перепрограммирование клеток с использованием не-интеграцииАдено или вирус Сендай ^9,10 векторы на основе ДНК ¹¹ или применение методов ДНК-бесплатно, как трансфекции синтетического мРНК ¹² или трансдукции рекомбинантных белков ^13,14. Другой перспективный метод для вывода трансгенной свободной IPSC является использование LoxP модифицированный лентивирусный перепрограммирования конструкций и последующего удаления трансгенов, используя систему ^15,16 рекомбинации Cre-LoxP ДНК.

Более простой подход к генерации нервных клеток для клеточной терапии замены представляет собой прямое преобразование фибробластов в постмитотических нейронов ^17-20. Vierbuchen др. Сообщили, что избыточная экспрессия транскрипционных факторов Ascl1, Brn2 и Myt1l результаты в поколение 20% нейронов из мышиных фибробластов ^17. В 2011 году было показано, что этот же три фактора транскрипции в сочетании с гиперэкспрессией NeuroD1 включить трансдифференцировки фибробластов человека в NeuРОНС ^19. Нейроны человека индуцированных может также быть получены путем избыточной экспрессии Ascl1 и Ngn2 под двойной SMAD- и GSK3β- торможения ^20. Примечательно, прямое преобразование фибробластов в нейроны генерирует непролиферативная, постмитотические клеточной популяции, которые не позволяют дальнейшее расширение и Biobanking.

Недавно прямого преобразования фибробластов в пролиферации клеточной популяции нейронных стволовых / клеток-предшественников сообщается ^21-26. Для ясности, все эти типы клеток будет называться индуцированных нервных клеток-предшественников (iNPCs) в этом докладе. Хан и др. Сверхэкспрессируется Brn4, Sox2, с-Мус и Klf4 генерировать iNPCs. Как и их коллеги нервных стволовых клеток, полученных из тканей либо основной или плюрипотентных клеток эти iNPCs являются tripotential и может быть дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты ^21. Наша группа сообщила немного другой протокол преобразования участием сверхэкспрессию Sox2, Klf4И с-Myc и Oct4 индуцированных выражение только 5 дней. При таком подходе мы могли бы генерировать стабильно пролиферирующих iNPCs из мышиных эмбриональных и взрослых фибробластов, которые обладают полной молчание перепрограммирование факторы ^22. В отличие от ИПСК, iNPCs не проявляют онкогенного потенциала после трансплантации ^27. Мы успешно использоваться превращают клетки в животной модели демиелинизации миелиновых, дефицитных крыс, демонстрируя, что iNPCs клинически полезны ^22. До тех пор, пока НПС может быть генерируется только из плюрипотентных стволовых клеток или первичной нервной ткани ^28-32. iNPCs стабильно расширяемая клетки, которые могут быть криоконсервированных и способны дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты. Много усилий было сделано, чтобы адаптировать прямой протокол преобразования из мыши с клетками человека ^23,26,33,34. В 2012 году она была опубликована, что избыточная экспрессия одного фактора Sox2 в фибробластах достаточно для создания мышиных и человеческих iNPCs <sдо 33>. Авторы сообщили поколение человека из эмбриональных iNPCs крайней плоти фибробластов и характеризуется их окрашиванием против Sox2 и нестин. Тем не менее, клетки-мишени, используемые для перепрограммирования представляют собой очень специфический тип клеток, которые не будут доступны в клинической практике, и не было никакой функциональной характеристики преобразованных клеток трансплантации в животной модели выполнена. Более недавняя публикация описывает генерацию нервных клеток-предшественников из ограниченных фетальных фибробластов человека избыточной экспрессией Sox2, с-Мус и либо Brn2 или Brn4 ^34. Сформированные клеточные линии показали самообновлению мощности и может быть дифференцированы в различные типы терминалов нейронов. Тем не менее, использование эмбриональных фибробластов является неблагоприятным, так как эти клетки являются гетерогенной происхождения и никто не может исключить наличие остаточной например, нервного гребня стволовых клеток в препаратах. В 2014 году Чжу и др. Сообщили прямое преобразование взрослого человека и неоНатальные фибробластов в tripotential нейронных клеток-предшественников сверхэкспрессией Sox2 вместе с Oct4 или Oct4 в покое и добавлением небольших молекул в клеточной культуральной среде. Следует отметить, что на основе их исследования Sox2 было недостаточно, чтобы вызвать прямое преобразование ^26. Совсем недавно, Лу и др. Сообщили, что избыточная экспрессия Яманака факторы Oct4-, Sox2-, Klf4-, с-Мус вирусом Сендай в течение 24 ч и последующей инактивацией вируса увеличением температуры приводит к генерации расширяемой tripotential нервной клетки-предшественники ^23. В заключение, хотя протоколы преобразования опубликованных для человеческих клеток до сих пор имеют в общем сверхэкспрессии по меньшей мере одного или более факторов YAMANAKA, часто в своевременной ограниченным образом, нет четкое указание минимальных молекулярных факторов, необходимых для управления прямой преобразование в iNPCs. Своевременно ограничено избыточная экспрессия Oct4 либо путем генетических средств, трансфекции с синтетическим мРНК, или сELL проникающий белок вместе с конститутивной экспрессии Sox2, КФК-4 и С-Мус не приводят к стабильным человека линий INPC еще. Таким образом, применение вируса Сендай для сверхэкспрессии все факторы YAMANAKA и своевременно ограничить свою активность путем термической инактивации вируса ²³ вместе с оптимизированных условиях нейронной медиа индукционных ^22,31 представляет собой предпочтительный стратегии до сих пор.

Несколько исследований показывают, сотовый функциональность НСК или их дифференцированных коллегами в различных моделях болезни животных. Нервные клетки-предшественники из человеческих плюрипотентных стволовых клеток были пересажены в мышиных моделях заболевания нейровоспалительных склероза ^35,36. Применимость чЭСК полученных нервных клеток-предшественников в EAE (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) -mice был впервые показан в 2008 году ^35. Мультипотентные нервные клетки-предшественники вводили в желудочки мозга мыши, и результат трансплантацииред в уменьшении клинических признаков ЭАЭ. Ким и др. Генерируются олигодендроглиальным прекурсоров из ЭСК и пересадить тех интрацеребровентрикулярно в EAE-мышей. Хотя пересадка не проживет больше 10 дней, мышей показали значительное улучшение неврологической функции и снижение провоспалительных иммунных клеток в белом веществе ^36. Стволовые клеточной терапии применяется также для доклинического адресности болезни Паркинсона, как НПС может быть успешно применен в соответствующих моделях животных. Для этого клетки-предшественники были либо получены из эмбриональной ткани головного мозга ³⁷ дифференцированной из плюрипотентных стволовых клеток или ^38-40 мезенхимальных стволовых клеток ⁴¹ были использованы. В 2012 году мы показали, что мыши iNPCs способны производить протеолипидного белок, основной компонент миелина белок, после трансплантации в мозг миелин-дефицитных (MD) крыс ^22. К этому доказательством правильности принципа эксперимента терапевтический applicabilность iNPCs был, во-первых доказано, и вскоре подтвердил и в другом исследовании ^32. Тем не менее, весь потенциал терапевтического использования человеческих iNPCs остается изучить.

Здесь мы показывают надежную и комплексного процесса (I) выводе человека из первичных клеток взрослых пациентов через биопсии кожи, (II) прямое преобразование фибробластов человека в состоянии нервной предшественников и (III) способность iNPCs быть дифференцированы в нейрональный и глиальные линий. Использование этого протокола позволит ускорить генерацию аутологичных клеток человека для терапевтического применения.