फ्लोएम चलनी तत्वों में विद्युत संकेतों को प्राप्त करने और मापने के लिए बिजली पहुंच ग्राफ (EPG) का एक नया आवेदन
Summary
Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.
Abstract
कोशिकाओं के electrophysiological गुण अक्सर अपने मूल वातावरण से उन्हें dissociating के बाद, इन विट्रो में अध्ययन कर रहे हैं। हालांकि, एक जीव में दूर की कोशिकाओं के बीच बिजली के ट्रांसमिशन के अध्ययन, विवो में उनके पैतृक पर्यावरण के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं के विरूपण साक्ष्य से मुक्त रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है। एक संयंत्र में unwounded क्षेत्रों को घायल से विद्युत संकेतों के प्रसारण के बाद से लंबे समय वनस्पति विज्ञानियों का ब्याज भी खफा है। फ्लोएम, संयंत्र भर में फैला हुआ है कि संयंत्र vasculature की रह हिस्सा है, पौधों में बिजली के पारेषण में एक प्रमुख ऊतक के रूप में माने जा चुका है। उपयुक्त electrophysiological विधियों की कमी विवो में फ्लोएम कोशिकाओं के बिजली के गुणों के अध्ययन के लिए कई चुनौतियों का बना हुआ है। यहाँ हम बिजली पैठ gra में एकीकृत रहने वाले एफिड्स, या अन्य फ्लोएम-खिला hemipteran कीड़ों का उपयोग करता है कि चलनी तत्वों के intracellular इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (सत्र), के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण पेशपीएच (EPG) सर्किट। इस विधि के बहुमुखी प्रतिभा, दृढ़ता, और सटीकता के लिए यह संभव रिकॉर्ड और मॉडल संयंत्र Arabidopsis thaliana 1 के मध्य नसों के सत्र में विस्तार से घाव प्रेरित विद्युत संकेतों का अध्ययन करने के लिए बनाया है। यहाँ हम EPG-इलेक्ट्रोड आसानी से सीमांत रगों में सत्र के intracellular electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए लागू किया जा सकता है, साथ ही कई बाहरी उत्तेजनाओं को बिजली के संकेतों के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए सत्र की क्षमता का अध्ययन करने के लिए चलता है कि। सत्र के intracellular इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए आवेदन किया EPG दृष्टिकोण संयंत्र / कीट संयोजनों की एक बड़ी संख्या में, पौधों की प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है, और कई शोध का उद्देश्य के लिए किया जा सकता है।
Introduction
लंबी दूरी की विद्युत संकेतों का उत्पादन करने की क्षमता बाहरी उत्तेजनाओं को कुशल प्रतिक्रिया के लिए अनुमति देता है कि बहु-कोशिकीय जीवों की एक लाभप्रद विशेषता है। यह विशेषता पौधों और जानवरों में स्वतंत्र रूप से विकसित किया है, और इस तरह संसृत विकास के एक मामले का प्रतिनिधित्व किया है। गहन अनुसंधान के विषयों विद्युत संकेतों को इस तरह के जानवरों में उत्तेजना प्रेरित विद्युत संकेतों के तंत्रिका संचरण और मांसपेशियों के संकुचन, आणविक आधार, संचरण की व्यवस्था है, और समारोह के रूप में पशुओं में महत्वपूर्ण कार्यों के साथ मिलकर कर रहे हैं कि दिए गए हैं। इसके विपरीत, पौधों में उत्तेजना प्रेरित विद्युत सिगनल छोटे से अनुसंधान ध्यान दिया गया है। पौधों कोई नसों या मांसपेशियों है हालांकि, पौधों पर्यावरणीय कारकों को अपनी प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा में है कि प्रोत्साहन प्रेरित विद्युत संकेतों को ग्रहण करने के लिए पर्याप्त सबूत नहीं हो रहा है।
फ्लोएम, संयंत्र वाहिका संरचना के रहने वाले घटक, एक प्रमुख उप के रूप में माने किया गया हैप्रोत्साहन प्रेरित विद्युत संकेतों के प्रसारण के लिए रणनीतियां, उत्तेजित से / गैर उत्तेजित / undamaged क्षेत्रों से 2 क्षतिग्रस्त कर दिया। फ्लोएम में मुख्य कोशिकाओं चलनी तत्वों (सत्र), अपेक्षाकृत सरल, लम्बी कोशिकाओं रहे हैं। सत्र के समाप्त हो जाती संयंत्र भर में फैला हुआ है कि एक सतत, कम प्रतिरोध, चलनी ट्यूब प्रणाली बनाने, अन्य सत्र से जुड़े हैं। इन अति विशिष्ट कोशिकाओं के बिजली के गुणों पर बहुत कुछ अध्ययन, हालांकि, वहाँ रहे हैं। इन पिछले अध्ययनों में, शोधकर्ताओं के साथ सत्र तक पहुँचा या तो कांच सूक्ष्म इलेक्ट्रोड stylectomy (काटने) के बाद एफिड्स के 3 या करने के लिए मिलकर कर रहे थे कि कांच इलेक्ट्रोड के साथ संयंत्र डाला stylets, 4। कांच microelectrodes व्यास में कम से कम 1 माइक्रोन के ठीक एक टिप में गर्मी के साथ एक छोर पर खींच लिया, और फिर एक KCl समाधान से भर रहे हैं कि गिलास केशिकाओं से बने हैं। KCl से भरे गिलास इलेक्ट्रोड में डाला एजी / AgCl या प्लैटिनम तार, तो एम्पलीफायर इनपुट से जुड़े हैं, और एक दिग्दर्शन हैइलेक्ट्रोड सर्किट को पूरा करने, ब्याज की सेल आसपास के स्नान में डाला जाता है। इस सेटअप कोशिकी दिग्दर्शन इलेक्ट्रोड और intracellular मापने इलेक्ट्रोड, यानी, सेल 5 की झिल्ली क्षमता के बीच क्षमता में अंतर के रिकॉर्ड करता है। इस विधि के साथ, Umrath शैवाल Nitella 6,7 का उपयोग करते हुए, एक संयंत्र सेल से पहले intracellular रिकॉर्डिंग कर दिया। Nitella एक अपेक्षाकृत सरल बड़े कोशिकाओं के साथ जीव, और intracellular इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए इसलिए उत्तरदायी है। इसके विपरीत, बहु-कोशिकीय, तीन आयामी स्थलीय पौधों के छोटे कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर कांच इलेक्ट्रोड की प्रविष्टि, तकनीकी रूप से मांग कर रहा है एक अत्यंत कुशल शोधकर्ता, साथ ही परिष्कृत दृश्य, micromanipulation, और विरोधी कंपन उपकरणों की आवश्यकता है। कांच इलेक्ट्रोड ऐसी जड़ एपिडर्मल कोशिकाओं के रूप में 8 पौधों में सतही कोशिकाओं से रिकॉर्ड करने के लिए उपयुक्त हैं, इंट्रासेल्युलर recordinकोशिकाओं से जी एस गहरा परिणामों भ्रमित, इस तरह के सत्र, बहुत संभावना कारण नुकसान प्रेरित प्रतिक्रियाओं के रूप में संयंत्र के ऊतक में एम्बेडेड। 1989 में, फ्रॉम और Eschrich, एक वैकल्पिक विधि के उपयोग की सूचना दी कांच इलेक्ट्रोड stylectomy 4 के बाद aphid stylets करने के लिए मिलकर कर रहे हैं, जिसमें 'aphid विधि' कहा जाता है। कांच इलेक्ट्रोड के रूप में करते लचीला stylets ऊतक या कोशिका क्षति का कारण नहीं है क्योंकि aphid विधि, कम आक्रामक है। Aphid stylets संयंत्र प्रवेश के लिए प्रकृति के महान आविष्कार कर रहे हैं, और एफिड्स काफी सत्र खोजने में मनुष्यों की तुलना में अधिक कुशल हैं। दुर्भाग्य से, इस aphid विधि भी तकनीकी विशेषज्ञता और उपकरणों के मामले में अत्यधिक मांग कर रहा है। Stylectomy के समय, स्थिरतापूर्वक एक एसई में डाला ख़ंजर साथ – इसके अलावा, इस तकनीक को लागू करता है कि प्रत्येक प्रयोग की सफलता के खिला मोड में किया जा रहा है aphid पर पूरी तरह से निर्भर करता है। पूर्वव्यापी में सोच रही थी, एक इस तकनीक की सफलता की बाधाओं मैं हो सकता था कि देख सकते हैंप्रयोगात्मक सेटअप करने के लिए stylectomy जब आवेदन aphid ख़ंजर एसई में है या नहीं, की पहचान करने की अनुमति देता है कि एक साधन जोड़कर mproved।
1964 में, मैकलीन और किन्से वास्तविक समय 9,10 में एफिड्स को खिलाने के व्यवहार के अध्ययन के लिए एक 'इलेक्ट्रॉनिक निगरानी प्रणाली' का वर्णन किया। इस प्रणाली में, aphid और ख़ंजर-penetrated संयंत्र एक बिजली के सर्किट में एकीकृत किया गया। बाद में, 1978 में, Tjallingii, प्रणाली का एक संशोधित संस्करण तैयार कर लिया 'बिजली पहुंच ग्राफ' (EPG) प्रणाली 11,12 कहा जाता है। मूल इलेक्ट्रॉनिक निगरानी प्रणाली प्रतिरोध उत्पन्न क्षमता के प्रति संवेदनशील था जबकि केवल, EPG प्रणाली के साथ, इलेक्ट्रोमोटिव बल (ईएमएफ) क्षमता, यानी, संयंत्र में या कीट में उत्पन्न, से उत्पन्न होने वाली क्षमता के अलावा दर्ज किया जा सकता है उत्पन्न कीट में प्रतिरोध (आर)। यह एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व दोनों संकेत घटकों, ईएमएफ और आर क्योंकि,एफिड्स द्वारा संयंत्र के प्रवेश के दौरान की घटनाओं पर जैविक प्रासंगिक जानकारी प्रदान करते हैं। क्या आर-घटकों के लिए EPG पूर्व एम्पलीफायर संवेदनशील बनाता संयंत्र / aphid प्रतिरोध के औसत के करीब है, जो 1 GΩ के अपने अपेक्षाकृत कम इनपुट प्रतिरोध है। एक छोटा सा ऑफसेट वोल्टेज (चित्रा 1, वी) लगभग 100 के एम वी तो एक तरफ पौधे और कीट भर में विभाजित किया गया है, जो संयंत्र, और अन्य पर इनपुट प्रतिरोध करने के लिए लागू किया जाता है। वोल्टेज और उनके परिवर्तनों कीट और इनपुट रोकनेवाला के बीच एक बिंदु (चित्रा 1 ए, बी) में मापा जाता है। ईएमएफ-घटकों कीट के कारण संयंत्र ख़ंजर नोक पर क्षमता और क्षमता का एक निश्चित अंश हैं, जबकि इसलिए, आर-घटक, ऑफसेट वोल्टेज के संयंत्र-aphid प्रतिरोध modulations प्रतिनिधित्व करते हैं। संयंत्र क्षमता – यहाँ सबसे अधिक प्रासंगिक – aphid stylets से हवा निकाल दी संयंत्र कोशिकाओं के मुख्य रूप से झिल्ली क्षमता रहे हैं। कीट क्षमता मुख्य रूप से होना दिखाई देते हैंदो ख़ंजर नहरों के भीतर तरल पदार्थ आंदोलनों की वजह से स्ट्रीमिंग क्षमता, यानी, भोजन और लार नहरों; कोई आंतरिक तंत्रिका या मांसपेशियों क्षमता EPG में दर्ज हैं। अभ्यास में, एक इलेक्ट्रोड टिप के रूप में ख़ंजर टिप कार्य करता है। सभी संयंत्र कोशिकाओं को नकारात्मक रूप से सेल के सकारात्मक बाहर करने के लिए रिश्तेदार के अंदर का आरोप लगाया है। विद्युत धारा (यानी, पानी के घोल में आयनों का आरोप लगाया आंदोलन) के बाहर और इसके विपरीत करने के लिए अंदर से बह बहुत कारण कोशिका झिल्ली के उच्च प्रतिरोध करने के लिए सीमित है। आम तौर पर विश्राम क्षमता स्थिर रखा जाता है। नकारात्मक आयनों बाहर चले जाते हैं या सकारात्मक आयनों कोशिका झिल्ली के माध्यम से में कदम हालांकि, जब झिल्ली क्षमता, यह depolarizes 'यानी, कम है। विध्रुवण सेल उत्तेजना के मामले में होता है। झिल्ली क्षतिग्रस्त और आयनों में और बाहर लीक कर रहा है जब झिल्ली में विशिष्ट आयन चैनल खोला है या कर रहे हैं जब आयनों तो में या बाहर चले जाते हैं। सभी कोशिकाओं टी में आयन चैनल और पंप हैवह सेल के अंदर विभिन्न आयनों की मूल एकाग्रता बहाल करने के अपने आराम के स्तर तक झिल्ली क्षमता लाने कि झिल्ली प्लाज्मा। विश्राम क्षमता और उसके परिवर्तन ईएमएफ घटक हैं, और इसलिए, EPG तकनीक उन्हें मापने के लिए उपयुक्त है।
1. EPG-इलेक्ट्रोड चित्रा। EPG इलेक्ट्रोड जिसका ख़ंजर स्थिर खिला मोड में एक चलनी तत्व (एसई) में डाला जाता है बिजली पहुंच ग्राफ (EPG) सर्किट, एकीकृत में रहने वाले एक aphid है। ख़ंजर-impaled एसई बाकी (पैनल) पर है, EPG द्वारा दर्ज सर्किट में वोल्टेज, स्थिर और विश्राम क्षमता स्तर (पैनल सी, बाकी) पर है। एसई उत्साहित है, तो वोल्टेज में एक क्रमिक वृद्धि (पैनल सी, विध्रुवण) के रूप में EPG में कल्पना की है जो अपनी झिल्ली depolarizes (पैनल बी),। एसई में आयनिक संतुलन यानी, यह repolar, आराम करने के लिए रिटर्न के रूप मेंizes, EPG द्वारा दर्ज वोल्टेज धीरे-धीरे बाकी संभावित स्तर (पैनल सी, Repolarization) के लिए कम हो जाती है। पैनल सी में, "ए" और "बी" क्रमशः पैनलों ए और बी में दिखाया गया है परिदृश्यों को देखें। वी = समायोज्य ऑफसेट वोल्टेज स्रोत है। री = इनपुट रोकनेवाला। 1 GΩ बाहरी अवरोध के समानांतर में, एम्पलीफायर (ग्रे में, पैनलों ए और बी) उच्च 1.5 TΩ अवरोध (OpAmp में) एक आंतरिक है। स्विच का रिमोट कंट्रोल से EPG पूर्व amp बेहद सटीक वोल्टेज मूल्यों को प्राप्त करने की अनुमति देता है, जो मोड ईएमएफ करने के लिए सामान्य से बदला जा सकता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
अगले भाग में, हम दोनों ध्यान केंद्रित-कीट और संयंत्र केंद्रित अध्ययन के लिए मान्य है कि EPG प्रयोगों प्रदर्शन के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल के साथ पाठक प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख बिजली पहुंच ग्राफ (EPG) रिकॉर्डिंग बनाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। EPG तकनीक अच्छी तरह से दुनिया भर में 100-200 सक्रिय उपयोगकर्ताओं के साथ, की स्थापना की है, और यह उदाहरण के लिए विभिन्न व?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VSR एक IIF मैरी क्यूरी अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (धरती में घाव, परिवर्णी शब्द के लिए: घाव Arabidopsis thaliana में विद्युत संकेतों को प्रेरित)।
Materials
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is x10 | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100Hz(softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
Riferimenti
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