체관부 체 요소에 전기 신호를 획득 및 측정을위한 전기 침투 그래프 (EPG)의 새로운 응용 프로그램
Summary
Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.
Abstract
세포의 전기 생리 특성은 종종 자신의 네이티브 환경에서 그들을 해리 후, 시험관에서 공부하고 있습니다. 그러나 유기체 먼 세포 사이의 전기 전송의 연구는 생체 내에서 자신의 네이티브 환경에 내장 세포의 유물이없는 기록을 필요로한다. 공장에서 unwounded 지역으로 부상에서 전기 신호의 전송은 긴 있기 때문에 식물 학자의 관심을 감정을 상하게했다. 사부, 공장 전반에 걸쳐 확산되는 식물 혈관의 살아있는 부분은, 식물에서 전기 전송의 주요 조직으로 가정하고있다. 적합한 전기 생리 학적 방법의 부족은 생체 내에서 체관부 세포의 전기적 특성의 연구에 많은 문제를 야기. 여기에서 우리는 전기 침투 감에 통합 사는 진딧물, 또는 다른 사부 공급 hemipteran 곤충을 사용 체 요소의 세포 내 전기 생리학 (SES)에 대한 새로운 접근 방식을 제시산도 (EPG) 회로. 이 방법의 다양성, 안정성 및 정확성은 가능한 기록 모델 식물 애기 장대 (1)의 중심 정맥의 SE들에 상세히 상처 유발하는 전기 신호를 연구했다. 여기서 우리는 EPG 전극 용이 한계 정맥 세포의 전기 생리 SE를 레코딩을 위해 구현 될 수 있으며,뿐만 아니라, 여러 외부 자극을 전기 신호로 응답 SE의 용량을 연구하는 것을 보여준다. SE의 세포 내 전기 생리학에인가 EPG 방식은 식물 / 곤충 조합의 다수의 식물 종의 다양한 구현에 많은 연구가 목적이 될 수있다.
Introduction
장거리 전기 신호를 생성하는 기능은 외부 자극에 대한 반응을 효율적으로 허용 다세포 생물의 유리한 특성이다. 이 특성은 식물과 동물에 독립적으로 진화, 따라서 수렴 진화의 경우를 나타내고있다. 집중적 인 연구의 주제는 전기 신호가 이러한 동물에서 자극 유발 된 전기 신호의 송신 및 신경 근육 수축, 분자 단위로, 전송 메커니즘, 및 함수 등의 동물에서 중요한 기능과 결합되는 것을 감안할. 대조적으로, 식물에서 자극 유도 전기 신호는 거의 연구 주목 받고있다. 식물이 더 신경이나 근육이 없지만, 식물이 환경 적 요인에 대한 그들의 반응에 중요한 역할을에서 그 자극에 의한 전기 신호를 가정 할 수있는 충분한 증거가있을 것 같습니다.
체관부, 식물 맥관계의 생활 성분은 주요 서브으로 가정 한자극 유발 된 전기 신호의 전송을위한 strate는 자극으로부터 / 비 자극 / 손상되지 않은 부분이 손상. 체관부의 주요 세포는 체 요소 (SES), 비교적 간단한, 가늘고 긴 세포이다. SE들 중 단이 공장으로 확산되는 연속적인 저 저항, 관 자체 시스템을 형성하는 다른 SE들에 접속된다. 이러한 고도로 전문화 된 세포의 전기적 특성에 대한 연구는 거의 그러나있다. 이러한 이전의 연구에서 연구자와 함께 SE를 액세스하거나 유리 미세 전극 stylectomy (절단) 후 진딧물의 3에 결합 된 유리 전극을 심고 삽입 stylets, 4. 유리 마이크로 전극은 직경이 1 ㎛ 미만의 미세한 팁으로 열에 일단 당겨 다음의 KCl 수용액으로 채워진다 유리 모세관으로부터 만들어진다. KCl을 채워진 유리 전극 삽입 자세 / AgCl로 또는 백금 와이어는 다음 증폭기의 입력에 접속하고있다 리파전극은 회로를 완성 관심 셀을 둘러싸 욕에 삽입된다. 이 설정은 지시 대상 외 전극 및 세포 측정 전극, 즉, 셀 (5)의 막 전위 사이의 전위차를 기록한다. 이 방법은 Umrath 조류 Nitella 6,7을 사용하여, 식물 세포에서 세포 내 첫번째 기록했다. Nitella은 비교적 간단한 많은 세포와 유기체, 세포 내 전기 생리학 실험하는 것이 의무이다. 대조적으로, 다중 – 셀룰러, 입체 육상 식물의 작은 세포에 세포 내 유리 전극의 삽입은, 기술적으로 요구하고 고도로 숙련 된 연구자뿐만 아니라 복잡한 시각화, 미세 조작 및 진동 방지 장치를 필요로한다. 유리 전극은 뿌리 표피 세포 (8)과 같은 식물의 표면 세포에서 기록하기에 적합하지만, 세포 내 recordin세포에서 GS 깊이 결과를 혼란, 같은 SE를, 아주 큰 원인 손상에 의한 반응으로 식물의 조직에 포함. 1989 년 프롬과 Eschrich는 다른 방법의 사용을보고 유리 전극 stylectomy 후 4 진딧물 stylets에 결합 된 '진딧물 법'이라고. 유리 전극처럼가요 stylets은 조직 또는 세포 손상을 유발하지 않기 때문에 진딧물 방법은 침습적이다. 진딧물의 stylets 식물 침투에 대한 자연의 위대한 발명이며, 진딧물은 상당히 SE들을 찾는 인간보다 더 숙련 된입니다. 불행하게도,이 진딧물 방법은 전문 기술 및 장비의 측면에서 매우 요구하고있다. stylectomy시에 안정적으로 삽입 SE와 탐침 – 또한,이 기술을 구현하는 각 실험의 성공은 급송 모드 인 진딧물에 전적으로 의존한다. 회고전의 생각, 하나는이 기술의 성공의 확률이 난을 수 있었던 것을 알 수있다실험 장치에 적용시 stylectomy 진딧물 탐침은 SE인지 여부를 식별 허용기구를 추가하여 mproved.
1964 년과 클린 킨제이 실시간 9,10에서 진딧물의 급전 동작의 연구 '전자 모니터링 시스템'바와. 이 시스템에서, 진딧물과 탐침 – 관통 공장 전기 회로에 통합 하였다. 그 후, 1978 년, Tjallingii, 시스템의 수정 된 버전을 고안 한 '전기 침투 그래프'(EPG) 시스템 (11, 12)를 불렀다. 원시 전자 감시 시스템은 저항 유래 전위에 민감한 반면 단, EPG 시스템, 기전력 (EMF)의 전위, 즉, 식물 또는 곤충의 발생에서 발생하는 전위에 부가하여 기록 할 수 유래 곤충에 저항 (R). 이것은, 중요한 개선을 나타내는 두 신호 성분, EMF 및 R 때문에,진딧물에 의해 식물의 침투 동안 이벤트에 대한 생물학적 관련 정보를 제공합니다. 무엇 R-구성 요소에 EPG의 프리 앰프는 민감한 만드는 것은 공장 / 진딧물 저항의 평균에 가까운 1 GΩ의 상대적으로 낮은 입력 저항이다. 작은 오프셋 전압 (도 1은, V)의 대략 +100 MV는 한쪽면에 식물 및 곤충에 걸쳐 분할된다 식물, 및 기타의 입력 저항에인가된다. 전압 및 변경 사항은 곤충과 입력 저항 사이의 점 (그림 1A, B)로 측정하고 있습니다. EMF-구성 요소가 곤충에 의한 식물 탐침 끝에서 전위와 전위의 특정 부분 반면 따라서, R-구성 요소는 오프셋 전압의 식물 진딧물 저항 변조를 나타냅니다. 공장 전위 – 여기에 가장 관련성이 – 진딧물 stylets에 의해 구멍이 식물 세포의 주로 막 잠재력이다. 곤충 잠재력은 주로 것으로 보인다두 개의 탐침 운하 내에서 유체의 움직임에 의한 스트리밍 전위, 즉, 음식과 타액 운하; 더 내부의 신경 또는 근육 잠재력은 EPG에 기록되지 않습니다. 실제로, 전극의 끝 부분으로 탐침 팁 기능. 모든 식물 세포에 부정적인 셀의 양극 외부에 대하여 내부에 충전된다. 전기 전류는 (즉, 묽은 용액으로 하전 된 이온의 이동) 외부 그 반대로 내부에서 흐르는 매우 인해 세포막의 높은 저항으로 제한된다. 일반적으로 휴식 잠재력은 일정하게 유지된다. 음이온 퇴실이나 양이온은 세포막을 통해 이동할 때, 막 전위가 '탈분극', 즉 감소된다. 세포 탈분극 자극시 발생. 멤브레인이 손상 및 이온과 누출 될 때 막에서 특정 이온 채널을 열 때 또는 이온은 또는 밖으로 이동합니다. 모든 세포는 T에서 이온 채널과 펌프가그는 셀 안에 다양 이온의 원래 농도를 복원하여 휴면 레벨로 막 전위를 가지고 막을 플라즈마. 휴지 전위와 그 변화는 EMF 요소이며, 따라서, EPG 기법들을 측정하는데 적합하다.
1. EPG 전극 그림. EPG 전극 누구 탐침 안정된 급송 모드 체 요소 (SE)에 삽입되어 전기 침투 그래프 (EPG) 회로에 통합 거실 진딧물이다. 탐침 – 찔려 죽은 SE는 나머지 (패널)에있는 경우, EPG에 의해 기록 된 회로의 전압은 안정과 휴식 전위 레벨 (패널 C, 나머지)에 있습니다. SE 흥분 경우, 전압의 점진적 증가 (패널 C, 탈분극)로 EPG 시각화 자사의 막 탈분극 (패널 B). SE의 이온 균형 즉, 그것은 repolar, 휴식을 반환으로izes, EPG에 의해 기록 된 전압이 점차적으로 나머지 전위 (패널 C, 재분극)로 감소. 패널 C에서, "A"와 "B"는 각각 패널 A 및 B에 도시 된 시나리오를 참조. V = 가변 오프셋 전압원. 리는 입력 저항 =. 1 GΩ 외부 저항에 병행하여, 앰프 (회색, 패널 A와 B) 높은 1.5 TΩ 저항 (OPAMP의) 내부 있습니다. 스위치의 원격 제어에 의해 EPG 프리 앰프는 매우 정확한 전압 값을 얻을 수있게, 모드를 EMF 보통에서 변경 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다음 섹션에서, 우리는 모두 집중 곤충과 식물에 초점을 맞춘 연구를위한 유효 EPG 실험을 수행하기위한 기본 프로토콜 리더를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는 전기 침투 그래프 (EPG) 녹음을 만들기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. EPG 기술은 물론 전 세계적으로 100 ~ 200 활성 사용자와, 설립하고, 예를 들어 서로 다른 주제에 대한 많은 연구, 구현되었습니다) 진딧물과 다른 탐침 베어링 곤충 (13)에 대한 호스트 공장 저항; b)는 식물 바이러스 및 병원균 전송 메커니즘 (14); 행동의 C) 살충제 모드 (독성과 행동의 변화) (…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VSR은 IIF 마리 퀴리 그랜트에 의해 지원되었다 (지구 상처, 약어에 대한 : 상처 애기 장대에서 전기 신호를 유도).
Materials
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is x10 | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100Hz(softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
Riferimenti
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
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