En ny anvendelse af elektrisk Penetration Graph (EPG) for at erhverve og måling af elektriske signaler i Phloem Sieve Elements

Evnen til at producere lange afstande elektriske signaler er et fordelagtigt træk af flercellede organismer, der giver mulighed for effektive reaktioner på eksterne stimuli. Dette træk har udviklet sig uafhængigt i planter og dyr, og repræsenterer således et tilfælde af konvergent evolution. Eftersom elektriske signaler kobles med vigtige funktioner i dyr såsom neural transmission og muskelsammentrækning, den molekylære basis, overførselsmåden, og funktion af stimulus-fremkaldte elektriske signaler i dyr er genstand for intensiv forskning. I modsætning hertil har stimulus-induceret elektrisk signalering i planter fået lidt forskning opmærksomhed. Selvom planter har ingen nerver eller muskler, synes der at være nok beviser til at antage, at stimulus-induceret elektriske signaler i planter spiller en central rolle i deres svar på miljømæssige faktorer.

Den floem, den levende komponent af anlægget vaskulatur, er blevet postuleret som en stor subStrate til transmission af stimulus-induceret elektriske signaler fra stimulerede / beskadiget til ikke-stimulerede / ubeskadigede områder ^2. De vigtigste celler i Phloem er sigteelementerne (SES), relativt simple, aflange celler. Enderne af SE er forbundet til andre selskaber, der danner en kontinuerlig, lav modstand, si rør, der er spredt i hele planten. Der er imidlertid meget få undersøgelser om de elektriske egenskaber af disse højt specialiserede celler. I disse tidligere undersøgelser, forskerne adgang SE med enten glas mikro-elektroder ³ eller med glas elektroder, der blev koblet til plante-indsatte stiletter af bladlus, efter stylectomy (skæring) ^4.. Glasmikroelektroder er lavet af glas kapillærer, der er trukket i den ene ende med varme i en fin spids på mindre end 1 um i diameter, og derefter fyldt med en KCl-opløsning. En Ag / AgCl eller platin tråd, indsat i KCl-fyldte glas elektrode er derefter forbundet til forstærkeren input, og en referentelektrode indsættes i badet der omgiver cellen af ​​interesse, der slutter kredsløbet. Denne opsætning registreres forskellen i potentiale mellem den ekstracellulære referent elektrode og den intracellulære måleelektrode, dvs. membranpotentialet af cellen ^5. Med denne metode Umrath foretaget den første intracellulær optagelse fra en plantecelle, ved hjælp af alger Nitella ^6,7. Nitella er et relativt simpelt organisme med store celler, og derfor modtagelige for intracellulære elektrofysiologi eksperimenter. I modsætning hertil indsættelse af intracellulære glaselektroder i de små celler af flercellede, tredimensionale landplanter er teknisk krævende, kræver et højt kvalificeret forsker, samt avancerede visualisering, mikromanipulering, og anti-vibration udstyr. Selvom glaselektroder er egnede til at optage fra overfladiske celler i planter, såsom root epidermale celler ^8, intracellulær recordings fra celler dybt forankret i plantens væv, såsom SE, meget sandsynligt forårsage skade-inducerede reaktioner, forvirrende resultaterne. I 1989 Fromm og Eschrich rapporterede brug af en alternativ metode, kaldet "bladlus metoden ', hvor glaselektroder er koblet til bladlus stiletter efter stylectomy ^4. Den bladlus metoden er minimalt invasiv, fordi fleksible stiletter ikke forårsager væv eller celler skade som glaselektroder gør. Bladlus stiletter er naturens store opfindelse af plantebeskyttelsesmidler penetration, og bladlus er betydeligt mere kvalificerede end mennesker med at finde selskaber. Desværre er denne bladlus metode er også meget krævende med hensyn til teknisk ekspertise og udstyr. Hertil kommer, at succes for hvert forsøg, der implementerer denne teknik er helt afhængig af bladlus er i fodring mode – med stiletten stabilt indsat i en SE, på tidspunktet for stylectomy. Tænker i retrospektiv, kan man se, at oddsene for succes denne teknik kunne have været improved ved til forsøgsopstillingen et instrument, der gør det muligt at identificere, om bladlus stiletten er i SE, når de anvender stylectomy.

I 1964 McLean og Kinsey beskrev et "elektronisk overvågningssystem« for studiet af adfærd bladlus fodring i realtid ^9,10. I dette system blev bladlus og stiletten-trængte anlæg integreret i et elektrisk kredsløb. Senere, i 1978, Tjallingii udtænkt en modificeret version af det system, kaldet systemet ^11,12 'Elektrisk Penetration Graph "(EPG). Hvorimod det originale elektroniske overvågningssystem var følsomme over for modstanden-stammer potentialer kun med EPG-system, den elektromotoriske kraft (emf) stammer potentialer, dvs genereres i anlægget eller i insektet kunne registreres i tillæg til potentialer, der følger af modstand (R) i insekt. Dette udgør en væsentlig forbedring, fordi både signal komponenter, emf og R,give biologisk relevante oplysninger om begivenheder i planter penetration af bladlus. Hvad gør EPG forforstærkeren følsom over for R-komponenterne er dens relativt lavt input modstand på 1 GQ, hvilket er tæt på gennemsnittet af planten / bladlus modstand. En lille offset spænding (figur 1, V) på ca. +100 mV påføres planten, som derefter er delt på tværs af plante- og insekt- på den ene side, og input modstand på den anden. De spændinger og deres ændringer måles ved et punkt (figur 1A, B) mellem insekt og input modstand. Derfor repræsenterer R-komponenter plante-bladlus modstand modulationer af offset spænding, mens emf-komponenter er en vis brøkdel af plante potentialer på stiletten tip og potentialer forårsaget i insekt. Planten potentialer – mest relevante her – er hovedsagelig membran potentialer plantecellerne punkterede af bladlus stiletter. De insekt potentialer synes at være overvejendestreaming potentialer forårsaget af flydende bevægelser inden for de to stiletten kanaler, dvs mad og spyt kanaler; uden indre nerve eller muskel potentialer registreres i EPG. I praksis stiletten tip fungerer som en elektrode tip,. Alle planteceller er negativt ladede inde i forhold til den positive ydersiden af ​​cellen. Den elektriske strøm (dvs. bevægelsen af ladede ioner i vandig opløsning) strømmer fra indersiden til ydersiden og omvendt meget begrænset på grund af den høje modstand af cellemembranen. Normalt hvilende potentiale holdes konstant. Men når negative ioner bevæge sig ud eller positive ioner bevæge sig i gennem cellemembranen, er membranpotentialet reduceret, dvs., det depolariserer «. Depolarisering forekommer i tilfælde af celle excitation. Ioner derefter flytte ind eller ud når specifikke ionkanaler i membranen åbnes, eller når membranen er beskadiget, og ioner lække ind og ud. Alle celler har ionkanaler og pumper i than plasmamembranen, der bringer membranpotentialet til sin hvilestilling niveau ved at genskabe den oprindelige koncentration af forskellige ioner inde i cellen. Den hvilende potentiale og dets ændringer er emf komponenter, og derfor EPG teknik er egnet til at måle dem.

Figur 1. EPG-elektroder. EPG-elektrode er en levende bladlus integreret i Elektrisk Penetration graf (EPG) kredsløb, hvis stiletten indsættes i en sigte element (SE) i stabil fodring tilstand. Hvis stiletten-spiddet SE er i hvile (panel A), spændingen i kredsløbet, registreres af EPG, er stabil og på den hvilende potentielle niveau (felt C, Rest). Hvis SE er ophidset, dens membran depolariserer (panel B), som er visualiseret i EPG som en gradvis stigning i spænding (panel C, Depolarisering). Som den ioniske balance i SE vender tilbage til hvile, dvs., det repolarizes, spændingen registreres af EPG aftager gradvist til resten potentielle niveau (felt C, Repolarisering). I panel C, "A" og "B" henviser til de tilfælde, der er vist i panel A og B, hhv. V = Indstillelig offset spænding kilde. Ri = indgangsmodstand. Parallelt med 1 GQ ekstern modstand, forstærkeren har en indvendig (i operationsforstærkeren) høj 1,5 TΩ modstand (panel A og B, i gråt). Ved fjernbetjening af kontakten kan ændres EPG pre-amp fra normal til emf-mode, som gør det muligt at opnå meget præcise spændingsværdier. Klik her for at se en større version af dette tal.

I det næste afsnit, vi give læseren en grundlæggende protokol for at udføre EPG eksperimenter, der gælder for både insekt-fokuserede og plante-fokuserede undersøgelser.